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                                                                奧林巴斯顯微鏡:浸入介質

                                                                2019-06-12 19:17:47 85

                                                                捕捉偏離光線從標本的顯微鏡物鏡的能力取決于兩者的數值孔徑介質,通過它的光的行進

                                                                immersion

                                                                數值孔徑的有關通過方程的成像介質:

                                                                數值孔徑(NA=?Nsin?μ

                                                                ?

                                                                其中μ是一個一半的孔徑角的物鏡?n是物鏡前透鏡和標本蓋玻片之間的介質的折射率

                                                                ?

                                                                如明顯的數值孔徑方程上述,一個物鏡數值孔徑是成正比的折光指數(n)的在成像介質的蓋玻片和前透鏡之間,并且也1的一半的角孔徑的的罪物鏡。因為罪惡μ可以不大于90度時,可能的最大數值孔徑的浸沒介質的折射率確定。大多數顯微鏡的物鏡使用空氣作為媒介,通過它的光線必須通過保護標本和前面的鏡頭物鏡之間的蓋玻片。這種類型的物鏡被稱為作為干的物鏡,因為它們是不使用液體的成像介質。空氣的折射率為1.0003,非常接近真空,并大大低于大多數液體,包括水組(n?=1.33),甘油組(n?=1.470)和常見的顯微鏡浸油(平均n=1.515)。在實踐中,被限制的干燥物鏡系統的最大數值孔徑為0.95,和更大的值只能使用用于浸漬介質的光學設計來實現。

                                                                浸油的原則,表現在圖1中,其中個別的光線追蹤的樣本,然后通入的物鏡,或在其他方向上折射。圖1a)示出的情況下,干燥的物鏡5條(標記為15)示出通過一個示例,用蓋玻片覆蓋。這些光線被折射在蓋玻片?-?空氣界面,只有最接近于光軸(光線12)的顯微鏡兩條射線進入物鏡前透鏡的適當的角度。第三射線蓋玻片約30度的角度的折射,而不會進入的物鏡。最后兩個射線(45)在內部通過蓋玻片反射回來,并沿與第三射線,有助于在傾向于降級的圖像分辨率的玻璃表面的光的內部反射。當空氣被取代油的玻璃,在圖1b)所示的相同的折射率,光線現在通過直通玻璃?-?油界面無偏差由于折射。因此,數值孔徑的增加,油的折射率為n的因子。

                                                                ?

                                                                設計用于浸油的顯微鏡物鏡有許多優于那些用于干燥。浸沒的物鏡通常是較高的校正(無論是熒光或復消色差的),并可以有工作的數值孔徑為1.40時,使用具有適當的分散性和粘度的浸油。這些物鏡允許臺下聚光隔膜被打開至更大的程度,從而延長照明的標本和利用的增加數值孔徑。

                                                                ?

                                                                一個經常被忽視的因素,增加數值孔徑時使用油浸物鏡是放在臺下聚光系統的限制。在油浸物鏡的NA=1.40的情況下,正被用于圖像臺下聚光器的較小的數值孔徑(例如1.0)的標本具有較低的數值孔徑的聚光鏡覆蓋的總的物鏡NA的系統被限制到1.0,在聚光鏡的數值孔徑。

                                                                ?

                                                                現代臺下聚光鏡往往具有高的數值孔徑在1.01.40之間的范圍內的值的校正程度(見我們對聚光鏡的部分)與。為了有效地利用浸油的所有好處,臺下聚光前透鏡和包含標本的顯微鏡載玻片的底面之間的界面時,也應浸在油中。一個理想的系統的示意性框圖在圖2中,已放置在浸油物鏡前透鏡和標本之間的接口,并在聚光鏡前面的鏡頭和底面樣本載玻片之間。

                                                                total oil

                                                                ?

                                                                該系統被稱為齊次的沉浸式系統,它是理想的情況下實現最大數值孔徑,并在光學顯微鏡的分辨率。在這種情況下,物鏡前透鏡,浸油,臺下聚光前鏡頭,和安裝介質的折射率和分散體是相等的或非常接近相等。在這種理想的系統中,可以通過一個傾斜的光通過聚光透鏡,并完全通過顯微鏡載玻片,浸油,和安裝介質油玻璃或安裝介質玻璃接口通過折射不偏執

                                                                ?

                                                                當使用高倍率的消色差透鏡油浸物鏡時,它有時是允許省略上油聚光鏡頂部透鏡的步驟。這是因為聚光鏡孔徑光闌必須經常與較小的校正物鏡減少消除工件,并提供最佳的成像。膜片尺寸的減少,減少的潛在增加數值孔徑的(上油聚光透鏡設置),因此在這些條件下,通常是在圖像質量的損失可以忽略不計。

                                                                ?

                                                                有已設計優化浸沒顯微鏡技術各種市售的合成油。許多國家紛紛發表自己的標準的必要的素質,浸油和國際標準組織已經認識到了ISO8036標準的光學性能通用的浸油:

                                                                ?

                                                                ?N?E?=?1.5180±0.0005(D?=?1.515
                                                                ?V?E?=?44±3(阿貝數-擴散指標)
                                                                ?溫度為23±0.1攝氏度

                                                                ?

                                                                除了嚴格控制的光學性質,浸油還必須表現出合適的物理化學特性,如非干燥的,惰性的光學表面的涂層,非熒光,化學惰性的,無毒的,并易于除去。大多數顯微鏡制造是專門匹配的物鏡色散特性,用自己的物鏡提供一個專門的浸油。請確定您所購買的售后油相匹配的物鏡,油的物鏡是滿足分散條件。許多舊的商業化生產浸入油(特別是超過10年前制造的)顯著量的多氯聯苯。這些油是致癌物質,應避免使用,但大多數較新的浸泡油是在沒有這種危險的化學品和使用是絕對安全的。浸油介質的主要制造商為Cargille?Laboratories,?Inc.,?Cedar?Grove新澤西生產的油五種標準類型:

                                                                ?

                                                                ?普通光學顯微鏡?-?最常見的浸油的會議分成兩個粘度要求(A型和B):1501250厘沲。這些油可以混合生成中間產物的粘度。


                                                                ?高粘度油(NVH)型?-?具有粘度為21000厘沲,這種油倒,水平和傾斜的應用程序和極長的工作距離物鏡標本,利用廣泛的聚光鏡差距,也為流行。


                                                                ?熒光顯微鏡(DF型)?-?油產生熒光顯微鏡的最高分辨率。這種油產生的背景色是淺綠色的。


                                                                ?熒光顯微鏡(FF型)?-?改進的油,基本上沒有背景熒光,是清晰的,非吸濕性。該油通常被稱為通用油,因為它可以取代的幾乎任何其他熒光應用浸油的信心。

                                                                1列出的cargille實驗室浸泡油最常見的三種類型的屬性。

                                                                ?

                                                                cargille浸油

                                                                屬性

                                                                型號?A

                                                                型號?B

                                                                型號?NVH

                                                                nF
                                                                (Hydrogen?F-line)

                                                                1.5236

                                                                1.5236

                                                                1.5227

                                                                nC
                                                                (Hydrogen?C-line)

                                                                1.5115

                                                                1.5115

                                                                1.5118

                                                                nD
                                                                (Sodium?D-line)

                                                                1.5150

                                                                1.5150

                                                                1.5150

                                                                ne
                                                                (extraordinary)

                                                                1.5180

                                                                1.5180

                                                                1.5176

                                                                Mean?Dispersion?(nF?-?nC)

                                                                0.0121

                                                                0.0121

                                                                0.0109

                                                                Abbe?Number
                                                                ?(VD)

                                                                42.6

                                                                42.6

                                                                47.2

                                                                Temperature?Coefficient
                                                                (-dn/dt)

                                                                0.00033

                                                                0.00033

                                                                0.00031

                                                                Fluorescence?(ultraviolet)

                                                                very?low

                                                                low

                                                                low

                                                                Viscosity
                                                                ?(cSt?or?mm2/s)

                                                                150?(low)

                                                                1250?(high)

                                                                2100
                                                                (v.?high)

                                                                1

                                                                ?

                                                                與普通的浸油的一個主要的問題是其固有的高的吸收特性,在紫外區域的頻譜(低于約375納米)。這并不影響與浸沒介質所做的可見光的光學顯微鏡的多數,但它可能會導致麻煩,當試圖在低于400納米的波長的圖像標本。甘油的紫外線吸收在400-350納米的區域是可以忽略不計的,所以純溶劑,或90:10的與水的混合物,可用于與近紫外顯微鏡浸沒技術。

                                                                ?

                                                                紅外(IR)顯微鏡與工件所產生的超過700納米的波長處吸收的浸漬材料也很復雜。紅外顯微鏡的唯一實際媒體是石蠟油,這也是有用的熒光浸沒顯微鏡,因為它具有可忽略不計的波長處的熒光下降到350納米。

                                                                ?

                                                                表2中列出的浸漬介質的折射率和有廣泛的各種不同的光學顯微鏡技術是有用的。大多數等于或低于玻璃的折射率的介質中使用的共同的生物學明場,相襯,DIC,和熒光顯微鏡。使用具有非常高的折射率,如溴萘和二*********,與專門的物鏡的那些媒體,以實現最高的數值孔徑和分辨率可能,也是非常有用的材料,其具有非常低的或變化的反射率的反射光顯微鏡中。

                                                                ?

                                                                常見的浸式介質

                                                                物質

                                                                折射率

                                                                空氣

                                                                1.0003

                                                                1.333

                                                                甘油

                                                                1.4695

                                                                燈油

                                                                1.480

                                                                柏木油

                                                                1.515

                                                                全合成機油

                                                                1.515

                                                                苯甲醚

                                                                1.5178

                                                                溴代萘

                                                                1.6585

                                                                二*********

                                                                1.740

                                                                2

                                                                ?

                                                                現代的組織和細胞培養技術的進步已經引發了興趣,能夠對圖像的活細胞和組織,都沐浴在生理鹽水溶液。生物體組織內的細胞動力學目前正在大量研究與定量的光學成像技術,包括共聚焦,微分干涉對比(DIC),和落射熒光顯微鏡。活細胞的平均折射率為1.35,非常接近周圍的緩沖水,生理鹽水組(n?=1.33),必須存在,以支持正在進行的細胞活動。當使用長工作距離干物鏡,可視化的液體,將掩蓋標本的詳細信息,從該表面的反射由于在水溶液中的組織培養細胞時,會出現一個問題。同樣地,使用浸油物鏡觀察活細胞也是有問題的因成像介質和水溶液的物鏡的前透鏡的玻璃之間的折射率差異。

                                                                waterobjs

                                                                ?

                                                                被設計成用于成像緩沖生理鹽水溶液中的細胞和組織中的圖3中示出的物鏡,同時提供足夠的房間的標本在觀察過程中的微操作。在一個43度角的鼻(或浸漬錐),房屋的前鏡片的物鏡是錐形的,允許提供方便地訪問到標本的機械手或微電極的方法,同時保持標本物鏡沉浸在一個陡峭的傾斜的解決方案。這些物鏡也有長工作距離范圍從2.0毫米(60X平場熒光),3.3毫米(10倍?-?40平場熒光),使標本的顯微操作的額外的空間,同時也是有用的。在這一系列的物鏡是可比的數值孔徑(通常是略高)典型的干平場熒光。這種類型的生產顯微鏡的主要公司,包括奧林巴斯蔡司徠卡尼康物鏡往往是制造商提供額外的配件,用于組織培養標本和其他生物標本的顯微。

                                                                ?

                                                                一個很好的示范精致的細節,看到水浸泡物鏡的分辨率和增強生活在組織培養的大鼠提睪肌的觀察圖4所示。

                                                                rats

                                                                ?

                                                                4a)是位于正上方的空氣/水界面的一個正常的干燥的4物鏡采取大鼠組織的顯微照片。注意標本的失真和模糊的發生是由于從水的表面的反射。這些效果被消除在圖4b),這是相同的視野的顯微照片,但使用一個4x水浸物鏡。此圖片是相當清晰的,較干燥的物鏡提供精致的細節顯示更高的分辨率。

                                                                ?

                                                                與成像的組織樣本的另一個問題是審查標本在高放大倍率時所表現油浸物鏡的分辨率和照度的有限的范圍內。在深度超過10微米的標本時,覆蓋蓋玻片,沐浴在水溶液中的浸泡物鏡通常失去其出色的成像性能。此問題在圖5中示出(a)如射線追蹤表明,在水介質中的一個球體扭曲成一個顯然是細長的橢圓形,當使用通過浸油具有n=1.515標本圖像的油浸物鏡。

                                                                distortion

                                                                ?

                                                                相同的球體保持球形,即使當使用水浸物鏡的成像光線仍然必須通過的折射率等于1.515的玻璃蓋玻片。水浸泡的物鏡還消除觀看標本通過水溶液時,往往會產生的球面像差。這些先進的物鏡還具有增加的軸向分辨率,經常等于數值孔徑的理論限制,它們產生特殊的對比度,分辨率,和提供了更高的照明強度。

                                                                ?

                                                                油浸顯微鏡技術提示?

                                                                顯微鏡中的第一規則是保持光學元件完全自由的灰塵,污垢,油,溶劑,和任何其他的污染物。顯微鏡時,應保持在低振動無煙房,可能是干凈的循環空氣的干擾最小。在顯微鏡上使用了防塵罩在不使用時,在密封的容器內,并保持所有配件。避免使用腐蝕性溶劑來清潔的顯微鏡,只能使用稀釋的肥皂水清洗非光學表面。油應保持技術和頭腦中的注意事項:

                                                                ?

                                                                ?第一步是找到一個低倍率物鏡和位置顯微鏡載玻片,讓標本與感興趣的區域是正視載物臺開口的中央部中。人們常常希望旋轉浸沒物鏡(無油)到位,以確保正確的位置的標本。為了達到最佳的結果,當使用油浸漬技術是很重要的,也適用油的底面的顯微鏡載玻片和最佳臺下聚光透鏡的形成兩者之間的,如下所述的油珠。大多數現代顯微鏡提供了一個相對寬的橢圓形的開口中的機械載物臺,以允許油顯微鏡載玻片的底部和在聚光鏡的前透鏡之間的區域中使用。

                                                                ?

                                                                ?擺動油浸物鏡的位置在物鏡轉換器,這將是下一個物鏡的光學通路旋轉到正上方的標本。使用一塊無絨紙或滴管將一小滴的油直接在鏡頭前的油浸物鏡。下一步,將另一滴的油蓋玻片上的正上方的區域進行成像。許多較新的奧林巴斯和尼康生產的油浸物鏡使用平凹前鏡片在浸泡物鏡,這是必要的步驟注油的物鏡前透鏡不能省略這些物鏡的。如果這些物鏡,以填補凹腔,可能會導致截留一個微小的氣泡,造成嚴重的眩光和圖像質量下降。

                                                                ?

                                                                ?慢慢地降低石油的物鏡,在顯微鏡的蓋玻片使用粗調焦旋鈕成小的油池。當油覆蓋的物鏡前透鏡使蓋玻片上的油接觸時,一個小閃光燈的散射光會被排放在油交界處,這兩個油池,合并。此步驟要非常小心,因為貨架的物鏡太靠近蓋玻片,可能會導致兩者之間的碰撞,有可能造成損害。

                                                                ?

                                                                ?將樣本慢慢地成為關注的焦點,使用粗調,直到細節才剛剛開始成為可見的,然后切換到適當的焦距微調,將樣本。它是重要的,以記住,在工作距離的最熒光和復消色差透鏡的物鏡是減少超過十分之一毫米的,在一個很窄的范圍內調節微調旋鈕,所以仔細監視的物鏡的做法油池而降低它的粗或細的調整。雖然大多數高倍率的浸油的物鏡有彈簧加載的可以縮回到主體的物鏡,這些物鏡的不小心使用的前端仍然可以驅動物鏡進入標本滑動造成損害。

                                                                ?

                                                                ?許多顯微鏡所使用的另一種方法是在顯微鏡的光路中,使用較低的倍率物鏡的中心的區域將被成像的位置。接著,油浸物鏡(無油的情況下)被放置到光路中,并且標本的感興趣區域的大致中心的視野帶入并集中。此預位置所有準備加入油中的系統組件。浸沒物鏡擺動顯微鏡物鏡轉盤相鄰站和適用油的物鏡前透鏡和標本如上面所討論的。接下來,快速旋轉上油的物鏡,上述兩個油滴(對標本物鏡之一)合并到一個池中的樣本的位置。現在已經準備好標本是觀察和顯微攝影。

                                                                ?

                                                                適用于石油臺下聚光鏡頭前,使用以下考慮:

                                                                ?請肯定的是,在顯微鏡的機械載物臺具有足夠的尺寸的開口,允許掃描不溢出的情況下的載物臺的底部上的油在油標本。許多先進的的研究顯微鏡有一個載物臺插入是可移動使用油。涂油的聚光鏡頂級鏡頭前取出標本的顯微鏡載物臺。

                                                                ?

                                                                ?在注油一個物鏡的類似的方式,放置在顯微鏡載玻片上的底部和一滴油臺下聚光的前透鏡的應用類似的下降。確保聚光鏡略有下降,在舞臺上的顯微鏡載片上,然后再更換機架。幻燈片后一直放置在舞臺上,機架背面的聚光鏡,到適當的位置,同時仔細觀察油滴的聚光鏡和顯微鏡幻燈片。這些液滴合并成一個,作為的聚光鏡被帶到正確的位置。

                                                                ?

                                                                ?當您掃描的表面上油顯微鏡幻燈片,定期觀察載物臺方面的物鏡聚光鏡的前鏡頭,以確保有一個連續的液滴這些元素之間的石油和顯微鏡幻燈片的位置。顯微鏡載片上在大面積上進行掃描時,它往往是必要重新應用一些油以保證連續性的成像介質。

                                                                ?

                                                                保持鏡頭的清潔,無油

                                                                一直努力,以確保您的顯微鏡的物鏡和聚光器前鏡頭保持清潔和浸油。許多制造商廣告非干燥,據報道,有這樣的蒸氣壓高的溶劑不會蒸發,留下結晶光學表面上的殘留物的浸油。在某些情況下,這可能是幾乎真實的,但它是危險的賭注,昂貴的光學設備。使用Q-尖或無絨紙或布輕輕擦拭多余的油的鏡頭和顯微鏡幻燈片實驗完成后,。后的油被除去,使用合適的溶劑中,以除去微量的浸漬油從鏡片。不正確清潔鏡片,可能會導致小晶粒上形成的涂層表面時浸泡的油干燥或收集從大氣中的灰塵和其他污染顆粒。



                                                                電話咨詢
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