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                                                                奧林巴斯顯微鏡:熒光顯微鏡解剖式講解

                                                                2019-06-12 19:13:25 84

                                                                到其他模式基于宏觀上的試樣的功能,如相位梯度,光的吸收,和雙折射的光學顯微鏡相比,能夠僅僅基于熒光發射性能的一個單一的分子種類的分布成像的熒光顯微鏡。因此,用熒光顯微鏡,與特定的熒光基團標記的胞內組分的精確位置進行監測,以及其相關聯的擴散系數,傳輸特性,以及與其它生物分子相互作用。此外,在熒光顯著的反應,以本地化的環境變量可以調查了pH值,粘度,折射率,離子濃度,膜電位,和在活細胞和組織中的極性溶劑。

                                                                fluoromicro figure1

                                                                最早的熒光顯微鏡配置的特點是古典的明或暗場透射(透射光)光學聚焦激發光通過過濾器到標本平面的列車。由物鏡收集熒光發射,以及具有顯著量的激發照明,并通過第二過濾器投射到目鏡隔膜形成中間圖像。由于激發光的強度,通常是幾個數量級大于熒光發射,在這些早期的透射光顯微鏡的試樣的視圖往往非常低的對比度和水浸散射的激發照明的背景上的重疊。使用高數值孔徑的油浸暗場聚光鏡照射試樣高度斜方位有助于消除大部分的背景噪聲,但并沒有提供足夠的照明,但最低數值孔徑物鏡。由此產生的圖像遭受貧困的分辨率和亮度很低的水平。

                                                                事件反射光或落射熒光顯微鏡照明最早是在20世紀20年代末在不透明冶金標本來觀察熒光。明場同行一樣,這些反射光的熒光儀器采用半反射鏡分光鏡被限制為約25%的整體效率(每次通過鏡子時失利后,50%的照明強度)。然而,反射光的熒光顯微鏡享受具有高數值孔徑的物鏡,作為聚光鏡的優點是,能夠生產具有顯著更高水平的亮度比在類似的數值孔徑的透射光顯微鏡圖像。此外,雜散的激發光反射回的物鏡(在高數值孔徑)降低到只有幾個百分點。物鏡的雙重作用,在反射光顯微鏡也大大簡化對齊的任務。僅僅聚焦到樣品上的物鏡建立的照明視野及視場使得入射的激發光,并遵循相同的路徑,通過顯微鏡的光學列車所觀察到的熒光發射。

                                                                緊湊汞蒸氣和氙弧放電燈的照明光源時,在20世紀30年代中期開發的技術進步的帶動下反射光熒光(至少金相)。在此期間,有色玻璃和明膠過濾器,也變得更加復雜,使該應用程序通過使用鎢鹵素燈的藍色和綠色可見光激發的熒光染料。防反射涂層和改良玻璃配方到物鏡設計的重大改進,在20世紀40年代,但最根本的入射光熒光顯微鏡的發展貢獻雙色分光鏡引進俄羅斯光學科學家Eugeny的布倫伯格(也稱為分色鏡)于1948年。這種創新克服與使用普通的半反射鏡的反射光顯微鏡的光損失的固有問題。由約翰S. Ploem 20世紀60年代中后期,是誰在發展野生萊茨Ploem Opak,含有多個光模塊是可以互換的,安置各種組合過濾器熒光顯微鏡反射光熒光顯微鏡,首次在大規模商業化

                                                                落射熒光顯微鏡的基本策略

                                                                反射光的熒光顯微鏡絕大多數是廣角非相干光源,以及那些用激光掃描共聚焦和多儀器進行的調查,目前的首選方法。這種普遍使用的熒光顯微鏡也被稱為入射光熒光,落射熒光,或簡單地落射熒光一個典型的現代的反射光的熒光顯微鏡,透射光觀察中還配備了多種對比度增強模式,提出如圖1所示。顯微鏡包含一個三目觀察頭,其耦合到電荷耦合器件(CCD)攝像系統,并具有兩個照明源,一個用于透射光,落射觀察(鎢鹵素和水銀弧光放電,分別) 。這種設計的顯微鏡可以合并或交替反射光熒光與透射光相襯,微分干涉對比(DIC),偏振光,或霍夫曼調制對比觀察。

                                                                fluoromicro figure2

                                                                任何熒光顯微鏡的基本特征是提供一種機制,用于激發的選擇性過濾照明試樣的更弱的熒光發射,使用第二個過濾器具有最大的靈敏度,使圖像形成深色背景上的隔離。本地化的探針在生物試樣中的濃度是如此之低,在許多實驗中,只有一小部分被吸收的激發光的熒光物種。此外,這些熒光團是能夠吸收一定量的照明,發射二次熒光的百分比,甚至更低。由此產生的熒光發射亮度電平的范圍為三至六個數量級小于的照明。因此,在熒光顯微鏡中最根本的問題是產生高效率的照明,試樣,同時捕捉微弱的熒光發射,有效地分開的更為激烈的照明帶。滿足這些條件的組合協調的激發和發射雙色分光鏡的行動和性能的基礎上要求的過濾器,在現代的熒光儀器。

                                                                在圖2中的假設的檢體含有綠色區域中被激發的熒光團在紅色(550納米)和發出熒光(620至660納米)波長的背后的原理,在反射光中的熒光顯微鏡的二色性分束器(反射鏡)的功能概述在可見光光譜。的高亮度光源的廣泛的激發波長為高磁通密度(通常是覆蓋大部分紫外線和整個可見光譜),通過所述照射器輸出和第一次遇到一個過濾器,用于激發選擇適當的波長帶(標記為EF,參見圖2(a))。在這種情況下,過濾器通過高效率地在510和560納米之間的光的波長,而且還允許其它波長的光,通過在較小的程度。的激發光下一個到達的二色鏡(DM在圖2中),被反射到物鏡后孔徑,形成一個光錐,沐浴試樣。的二色性反射鏡在光路中的位置,在以45度的角度,設計為選擇性地反射波長在490和565納米之間(圖3中所示),同時發送兩個較短和較長的波長。

                                                                在圖3中使用的過濾器的組合,單獨的激發光照在圖2中,從熒光發射的傳輸的檔案。激發濾光片光譜(紅色曲線)表現出高的水平(約80%),在510和560納米與535納米的中心波長(CWL之間傳輸二色鏡(黃色曲線)反映了在該區域的激發光譜的波長,通過較高和較低的波長時,以相對較高的效率。需要注意的是0%的透射二色鏡曲線上對應于100%的反射。的突出浸在490和570納米之間的,代表的峰值反射率的傳輸特性文件,用于反映通過在一個90度的角度,到樣品上的激發光濾光片的波長頻帶。中的最終組件的光的列車,排放量或屏障過濾器(白色曲線),發送波長大于590納米,這對應于具有黃色,橙色和紅色的顏色的可見光。的各種疊加的光譜的透射和反射的波長帶之間的界限被設計成盡可能陡峭的反射和透射的波長,以確保幾乎完全分離。正弦上升沿和下降沿尖峰出現在二色鏡光譜的圖案,是一種常見的薄膜沉積過程被稱為振鈴效應過濾器組合的表現,這是顯著的,并,實現薄膜 ??干涉濾光片技術的迅速發展,是一個明確的示范。

                                                                fluoromicro figure3

                                                                因為只有一個窄帶寬的光反射的二色鏡,照明波長小于490納米,長度超過565納米的管理,通過激發濾光片也透過二色鏡,示出的光,截止在圖2(a)。注意的激發光的反射是不是100%的效率,因此,少量的綠色光通過而不被反射的二色鏡。此外,并不是所有的透過反射鏡565或低于490納米以上的光的波長。這種光的一小部分被反射,通過物鏡由反射鏡到標本。從激發光濾光片的透射光通過二色鏡(光,在圖2(a)截止)被部分地吸收由平坦的黑色表面涂層的過濾器塊的內部,但一些從表面反射,并穿過成斜角的屏障過濾器,導致熒光背景噪聲。

                                                                熒光發射由檢體(主要為紅色波長),這會導致從綠色光激發,收集的物鏡和通過二色鏡和屏障過濾器(以上的光切斷,在圖2(c))。的屏障過濾器(在圖2中標記為BF)是專門設計允許只有波長大于590納米的光到達顯微鏡目鏡和/或檢測。在服務這一責任,阻擋過濾器有效地防止從檢體(和成功穿過二色鏡)到達探測器反射的激發光的波長。然而,大多數從檢體返回的激發波長的激發光濾光片和照明器反射向由二色鏡(下面的光切斷,在圖2(c))。在圖2和圖3中示出的過濾器配置的凈效應是分開的激發光,這是相當高的強度,從弱得多的熒光發射。在所有情況下,如附圖中所示,在熒光顯微鏡中所涉及的過濾器的截止水平不是絕對的,而是使一些光波長范圍以外的滲透。事件的整個順序以圖形形式顯示在圖2(b)中,示出所需的高效反射光的熒光顯微鏡的光學路徑和戰略濾波器裝置。

                                                                垂直熒光照明

                                                                ?

                                                                應的現代熒光顯微鏡的心臟是普遍的反射光垂直照明,觀察觀看管和攜帶的物鏡,如在圖1和圖4中示出的物鏡轉換器之間。所述照射器被設計成直接產生的光到樣品上通過第一通過顯微鏡的物鏡的光傳遞的方式向試樣,然后使用相同的物鏡捕捉到的被檢體發出的光,由高強度的源。這種類型的照明策略有幾個優點。下一個顯微鏡物鏡,它的作用首先,作為一個良好的校正后的聚光鏡,集傳送到目鏡或相機檢測系統的圖像形成的熒光發射。因此,其物鏡是始終在正確的取向相對于每個這些功能。此外,大多數由檢體(超過360度的角度),散射或反射的激發光的行進相差的物鏡前透鏡元件,而不是被直接投影到玻璃的情況一樣,在發射的熒光照明。這種效應被稱為作為前端面照明,與厚的樣品是特別有用的。最后,試樣被照亮的區域被限制到被觀察的相同的區域中,照明和光收集可以利用完全的客觀的數值孔徑。

                                                                在遠端的垂直照明燈箱(見圖4),其中包含了高強度的電弧放電或燈絲的白熾燈光源。最流行 ??的照明源是100瓦的高壓汞燈(HBO,通常稱為燃燒器),但氙氣和金屬鹵化物弧光燈,激光,和鹵化鎢白熾燈可以達到同樣目的。由源發射的光通過聚光透鏡系統和沿著所述照射器的內部,在桌面上,并垂直于顯微鏡光軸平行聚焦。圖4中所示的照明器的設計包含了多個組件的聚光透鏡系統,但也正在實施,以提高在近紅外和紫外區域的色差校正非球面透鏡元件。的熱的目的是消除或抑制紅外線的波長的過濾器被放置燈箱內或相鄰的燈箱安裝在后方的垂直照明。此外,一些顯微鏡包含一個雙或多波段激發平衡器系統(參見圖4和圖8)燈箱附近選擇性地過濾,將不再需要以微調的熒光過濾器的性能集包含激發波長的對所述照射器的另一端。

                                                                fluoromicro figure4

                                                                此外,附近的垂直照明燈箱中的定位是一組中性密度過濾器,可以被用來調整光通過系統的整體強度,并降低熒光褪色或漂白。這些過濾器通常安裝在滑塊的幀,使他們能夠快速插入和刪除從光路,一邊欣賞標本熒光。為了建立科勒照明,垂直照明燈包含一個的定心孔徑和視場光闌的組合,兩者都具有可變光圈孔徑決定該字段的大小和光照強度。圍繞光圈和視場光闌的光圈大小的調整是通過幾對位于每個外側的垂直照明器殼體的旋鈕。在某些設計中,滑動旋鈕,可以消除從光路,所述照射器的光通過量最大化整個膜片組件。其他顯微鏡包含安裝在一個滑塊,可以被插入到光路中,專門的應用程序,如熒光漂白后恢復(FRAP)調查,極大地限制了照明視野光圈的固定大小的針孔

                                                                在垂直照明光學列車的字段和光圈隔膜是場透鏡,這是必要的傳播的光,并產生足夠的照明場建立科勒照明。后場鏡頭,所有現代的垂直照明含有光快門(手動開關控制),阻止強烈的激發光到達過濾器的熒光時沒有被觀察或記錄集和標本。百葉窗是一個關鍵的特征,因為在熒光顯微鏡標本連續照明可以大大減少由于漂白排放,高強度的光對活體細胞是不健康的。此外,快門使電弧放電燈保持活躍(減輕了一場熱身期間),而標本瞬時透射光檢查。高端熒光顯微鏡通常配備了電子快門,提供快速和遠程控制照明。裝配到照明器殼體的前部,以保護操作者免受任何意外泄漏的潛在危險的短波長的紫外線輻射時,在快門開啟的紫外線防護罩(在圖4?breathshield類別)。盾提供雙重職責,也保護了標本觀察時呼出一口氣。

                                                                幾個垂直照明設計提供了一個插槽矩形的偏振片幀,可以采用熒光偏振調查。在大多數情況下,偏振器被插入后面的場透鏡(相差的一個共軛面)的照明光路中,但前的光快門(參見圖4)。的偏振片可以被固定到適當的位置與預先確定的傳輸方位角,或安裝到齒輪組,允許通過使用一個指輪要變化的透射軸的方向。由于偏振器被安裝在一個滑動架,它可以很容易地在不使用時從光路中移除。隨附的分析儀(第二偏振器所必需的熒光各向異性測量)可以安裝在垂直照明器,過濾器塊炮塔,或在一個專門設計的中間管的偏光顯微鏡輔助管往往使刻度,旋轉偏振器單元的插入分析儀發送的方位角相對于偏振器和顯微鏡光軸,以確保準確的定位。

                                                                垂直照明的最后階段,包含一個旋轉的轉臺或滑動支架容納光學塊,含有熒光的過濾器組合。該過濾器塊旋轉(或滑動)進入光的列車,當需要用于成像的特異性熒光濾光器組合。單個塊包含一個匹配的激發和發射濾光片組,以及二色性分束器,仔細定位,以最大限度地提高試樣的照明,在特定波長的熒光發射和捕獲。光學塊炮塔和滑塊托架可以裝載3和6之間有一個定位在光路中的各個塊,其余的旋轉或滑動的方式臨時存儲。這些附件可快速切換熒光過濾器集觀察標本時,有兩個或兩個以上的熒光探針標記。配備熒光照明在顯微鏡透射照明的使用促進了虛擬光學塊放入炮塔或滑塊托架上的插槽。偽塊激發發射(當快門打開時),但不包含任何過濾器,允許光通過不受阻礙地從客觀觀察管。

                                                                在標準模塊化直立顯微鏡,垂直照明定位顯微鏡之間的框架和觀察管(參見圖1)。許多制造商提供偏光片,DIC棱鏡,或是其它配件的照明和目鏡單元之間可以插入中間管。現代顯微鏡幀通常是由于計算機輔助設計努力的結果顯著的減振和增強的人體工程學特性。合成材料,如金屬基體陶瓷和鋁的復合材料,顯著地提高靜態和熱剛性的框架,從而使該儀器能夠承受先進的熒光技術的嚴格要求,需要幾乎完全消除所需要的時間在長時間的振動弱熒光成像。

                                                                科勒照明在熒光顯微鏡

                                                                在熒光的垂直照明,是這樣定位的光源的燈絲或電弧放電等離子球位于附近的聚光透鏡的主要焦點。科勒照明燈聚光透鏡供應顯著放大的二次光源,以提高整體照明的功能。科勒照明的一個主要要求是,最終必須的燈絲或電弧的圖像投射到后側焦點面上的物鏡,也兼作反射光照明的激發過程中(通常是高的數值孔徑)聚光鏡。上述光源最好填滿整個物鏡孔徑,同時最大限度地提高的輻射強度,以產生均勻照明的字段。在某些情況下,接地的玻璃過濾器放置到垂直照明燈箱和中性密度濾光片之間,以增加照明的均勻性,特別是當采用弧燈,往往會產生過多的強度的區域(稱為熱點)。但是,由于擴散過濾器的照明水平也降低了,他們應盡可能避免。

                                                                fluoromicro figure5

                                                                在反射光科勒照明(在圖5中示意性地示出)的光源,圖像被聚焦到位于在垂直照明器的孔徑光闌的聚光透鏡。此隔膜共享一個共軛面與后孔的目的和燈的電弧或燈絲,因此,確定的照明場光圈的大小。在一起,構成了照明光源,垂直照明孔徑光闌,和客觀的后側焦點面(瞳孔)共軛的平面設置。在透射光顯微鏡的情況不同,孔徑光圈和光源成像到的物鏡(作為聚光鏡)后開口面,而不是在該位置處的物理位置。作為該結構的一個額外的好處,所有的障礙物(如光闌)時,從光路中移除的物鏡是,提供激發照明或者形成圖像,從所收集的熒光發射。打開或關閉的孔徑光闌是用來控制雜散光,并沒有改變,照明場的大小來調節的強度(數值孔徑)的照明。在圖像中,孔徑光闌的調整會影響亮度和對比度。

                                                                在反射光中科勒照明的共軛面上的圖像形成或字段集包含的視場光闌,在試樣表面,中間圖像平面。因此,當在試樣平面視場光闌被放置在焦點中,圖像的光源的顯著焦點從除去,以提供均勻的照明領域。視場光闌控制的照明場的大小,而不會影響所觀察的區域的照度。在實踐中,視場光闌的開口的大小應盡可能地小,以增加圖像的對比度和降低的程度不被直接觀察到的區域中的光漂白。科勒照明產生均勻的照明試樣字段,盡管所產生的電弧放電和燈絲的光源的照度不均。當顯微鏡配置正確,后焦平面的物鏡是完全照亮,提供一個領域是從邊緣到邊緣均勻光亮。科勒照明,在理想情況下,沐浴試樣組的波陣面,每個進入聚光鏡孔徑成像的光源所產生的單獨的點上的會聚。在適當配置的熒光顯微鏡,其結果是獲得最佳圖像的對比度和分辨率。

                                                                光源和燈室

                                                                對于嚴格的定量分析,在熒光顯微鏡,標本的照度必須是時間和空間的不變在整個視場。隨著時間的推移不穩定普遍反映燈的光芒,由于電力供應輸出變化發生波動。相比之下,最常發生弧光燈,空間障礙,出現的現象被稱為閃爍電漿球電極之間來回遷移。閃爍一般是通過電源波動,電極電阻的微小變化,或機械振動。基于燈絲的光源,例如流行的鎢鹵燈,是非常穩定的條件下操作時,恒定的直流電流與穩壓電源。在一般情況下,應選擇光源,從它們的光譜內容,燈絲尺寸比較客觀后方開口面積,空間和時間上的穩定性,和視場照明的均勻性。必須認真注意還可以考慮窄頻帶的波長的光源的強度,因為通過激發濾光片包括:只有一個非常小的部分的總的照明器的輸出。

                                                                首要考慮的是在選擇熒光顯微鏡的光源,用于在被調查的熒光染料的量子產率和吸收紫外線和可見光的光的光譜分布。此外,源必須是兼容的捕獲圖像所用的檢測器的靈敏度,無論是人眼來說,傳統的薄膜,光電倍增管,加強視頻管,或數碼相機系統。的選擇還依賴于模式的照明。廣角熒光顯微鏡與電弧放電或鹵鎢燈來源的要求得到滿足,而聚焦和多光子顯微鏡需要適應各種激光系統。鎢和鎢 - 鹵素白熾燈已被使用了有限的成功,由于這樣的事實,其排放的大多數發生在紅光和紅外區域的光的頻譜,由紫外線,藍色和綠色的波長,而多數的被激發的熒光團。此外,輸出的光從弧放電燈的10倍和100倍的亮度比通常用于透射光照明的石英鹵素燈12伏之間的范圍。在寬視場熒光顯微鏡喜愛的照明光源是汞弧燈,它通常是常規包括在基本模型顯微鏡配置。在某些情況下,氙氣和金屬鹵化物弧光燈,但這些通常僅限于專門的光的頻譜和強度分布圖的情況下,與特定的熒光團的要求相匹配。

                                                                fluoromicro figure6

                                                                汞和氙氣燈的設計是類似的,除了括在燈泡外殼的物理尺寸和氣體。汞燈包含兩個電極密封在高壓下,還包含汽化元素汞在石英玻璃燈泡。當電源通電時,一系列的高電壓脈沖被發送到電極,電離的水銀氣體的一小部分,點燃的燈。在燒成后,電壓被減少,電離的氣體供應承載電流的產生,在兩電極之間形成的等離子體球。在燈工作期間,汞的汽化會產生大量的熱和壓力的玻殼內,最終產生的高強度的光。汞弧燈產生的光,即使連續的紫外和可見光譜集中在離散波長為365,400,440,546,和580納米。氙氣燈在整個頻譜中有更均勻的強度分布圖,從紫外到紅外。在確定適當的光源,熒光顯微鏡熒光染料的選擇是至關重要的。一些熒光探針的激發帶,配合突出的汞線,而其他受益分布比較均勻照明的氙燈。

                                                                在熒光顯微鏡中的弧光燈的適當的對齊是至關重要的,以實現科勒照明,以避免在熒光圖像的亮區和暗區。因此,在燈箱的質量往往可以判斷對應正確的燈的穩定性和由調整旋鈕的效率保持對齊。的燈座應配備燈定心螺釘允許為中心的圓弧的圖像中的物鏡的后孔,燈箱應包括一個紅外的波長很長的過濾器來阻止遠紅光和紅外光,產生大量的熱量。幾個燈箱的設計有一個內置在紅色抑制濾波器(例如,一個肖特BG38),或一個時隙為這樣的過濾器,以消除在某些應用中的視場看透紅色背景。此外燈箱本身不應泄漏有害的紫外線的波長,優選地,應設有一個開關自動關閉燈泡殼體在操作過程中被不經意地打開。最后,燈箱應該堅固,足以承受在操作過程中可能燃燒爆炸。

                                                                熒光顯微鏡應用廣泛的多樣性常常呼吁為光源,以滿足特定熒光成像條件。在某些情況下,需要非常低的照射可結合一個超靈敏的照相機系統,而對于其他的調查中,強激光的激發可能是必要的,以便殺死活細胞或選擇性地漂白的熒光團。波長的要求通常跨越整個可見光譜區中的,以及部分的紫外線和紅外線。因為這些多個照明要求不能滿足單一光源,制造商現在提供適配器,使兩個或兩個以上的燈可以同時連接到一個單一的顯微鏡。

                                                                熒光濾光片組合

                                                                正如前面所討論的,垂直照明光通過透鏡和隔膜終于遇到激發光濾光片,安置在一個光學塊的位置,以配合所述照射器的光路和顯微鏡的光學列車的軸線之間的交點。激發光濾光片選擇從廣泛由燈所產生的光譜的波長的窄頻帶,并且將它們傳遞到二色鏡,這反過來,反射光的通過物鏡到標本。由物鏡聚集的熒光發射通過再次通過二色鏡,并在固定的目鏡膜片形成圖像之前的排放量或屏障過濾器。常用的過濾器進行分離波長頻帶的寬視場熒光顯微鏡,包括有色玻璃濾光片和干涉薄膜過濾器(或兩者的結合)。確定合適的過濾器中每一步的熒光顯微鏡的照明和成像計劃會引起混亂,由于大量涉及過濾器的制造商,這有助于一個專有的字母數字命名的熒光文獻。

                                                                一個典型的熒光過濾器塊的解剖結構的示意性圖解在圖7中,隨著二色鏡,激發和阻擋過濾器相關的頻譜檔案。過濾器可以阻止通常由生產商提供的自定義工具組裝在一起,因此,操作員可以互換濾波器和二色鏡。激發和阻隔過濾器固定到位的固定夾,光學膠,或圓形螺紋安裝(見圖7)。在一般情況下,這些過濾器可以除去,因為它們被定位在在平坦的外表面的凹孔的光學塊,而無需打開。更換二色鏡是比較困難的,并且需要完全拆卸的塊,以獲得進入內部。大多數塊部分投用45度對角線聯合提供雙重職責,保護內部和適當的角度支持雙色鏡。取出后塊部分(標簽或小螺釘)的緊固件,反射鏡可以被刪除,通過松開或移動的固定夾,然后非常仔細地滴塊。雙色鏡應謹慎處理,因為通常不會干涉鍍膜保護,可以很容易劃傷。幾個誰提供售后過濾器和各種熒光應用雙色鏡,顯微鏡公司還提供了多種選擇的過濾器制造商。

                                                                fluoromicro figure7

                                                                熒光濾光片的設計包括長通,shortpass(邊緣濾波器),帶通濾波器和窄,中,寬的家庭。一些常見的過濾器配置文件的實施例示出由圖7中給出的光譜。發射濾光片光譜(藍色曲線),在圖7中所產生的一個長通干涉濾光器,具有約575納米波長的切口上。通過過濾器發送較長的波長更短的波長,而被阻止。從相同的一組(紅色曲線,圖7)有一條狹窄的帶通激發濾光片約20納米的帶寬,而在二色鏡(綠色曲線)近似的培養基中(455-490納米),和寬的帶通濾波器(560具有透射區域-775納米)。由于二色鏡有效地作為一個長通濾光片的綠色,黃色和紅色區域的可見光譜(560到700納米),它被視為這樣的過濾器集。如何熒光吸收和發射光譜的熒光顯微鏡,可以用來選擇合適的過濾器設置的工作知識是這項技術的成功實施至關重要。

                                                                雙色鏡(分光鏡)在熒光顯微鏡過濾器組合,是最關鍵的部件,類似于長波干涉型濾波器,多層介電材料制造緊公差。二色性反射鏡和一個標準的干涉濾光器之間的主要區別是,鏡子是專門設計用于在定義的邊界波長的反射和透射,必須工作在以45度的角度相對于顯微鏡和照明器的光軸。二色性反射鏡的位置與面臨的激發光源的干涉涂層,以反映潛在的激發波長在一個90度的角度通過光火車試樣。相同的反射鏡也必須作為發送濾波器,通過從物鏡到像平面的長波長的熒光發射。因為幾乎全反射及最大傳輸的波長之間的過渡區域往往局限于只有20納米或30納米,二色鏡是能夠精確區分激發和發射波長。

                                                                設計,使一個特定波段的激發波長完全匹配的二色鏡的反射區域在熒光濾光片集。其結果是有效地通過顯微鏡觀察,到樣品上的激發光的反射。從檢體的熒光發射必須與高透射區域中的二色鏡,以使通過這些波長的檢測器。屏障過濾器的總體方案中是不太重要的,但仍然起著重要的作用,在確保散射和反射的激發波長,熒光物鏡以外的探針,和一般的背景由于自體熒光的強度被刪除。在創建過濾器設置的最重要的因素是做出一定的透射,反射和發射的配置文件中所涉及的過濾器匹配適當的區域。否則,激發波長可能能夠通過雙色鏡和霧圖像,或者熒光發射,可以在不經意間反映在鏡子危及圖像亮度

                                                                即使在看似完美的匹配濾波器的組合,個人濾波器的光譜之間發生的輕微重疊,以減少性能。特別令人關注的是激發光濾光片和二色鏡,從而使部分的激發光通過鏡子反映從過濾器塊的壁之間的串擾。高度傾斜的角度處反射的光可以部分地透過的屏障過濾器,如上面所討論的,以降低圖像的對比度。通過過濾器的這種類型的泄漏被稱為滲色交叉,發生或大或小的程度上,幾乎所有的過濾器組合。兩個過濾器的制造商和顯微鏡公司關注的主要領域之一是,提高了設計的熒光的過濾器組合,以減少交叉的水平。

                                                                fluoromicro figure8

                                                                熒光過濾器組的配置如圖8所示。的過濾器塊,轉塔(圖8(a))包含了5個塊,同時調查的快速切換濾光片組合的熒光基團的至少一些。炮塔插槽通常是充滿了一個虛擬的光學模塊或透射光觀察空置。是完成了與激發平衡器(圖8(b)),它包含一個單一的干涉濾光器安裝在旋轉微調的激發光譜成像雙重或多重標記的標本。旋轉調節桿的激發平衡器移動的過濾器,以更短的波長的帶通透射區域。因此,當平衡器過濾器是從零度入射角(垂直于垂直照明軸)的最大旋轉角度為45度的旋轉,過濾器的帶通區域的可移值的范圍在25和50納米之間。勵磁平衡器可單獨使用或串聯下觀察,以平衡的發光強度來改變熒光染料的激發帶寬。此功能使標本中包含多個探針的熒光強度進行微調,例如,減少的熒光發射一個探測器,同時增加了強度另一個。

                                                                薄膜涂層技術的快速進步,證明了在一個單一的干擾濾波器和制造交錯帶色鏡的反射和透射能力建立多個傳輸峰。正確匹配時,兩個多頻帶濾波器和一個二色鏡可以結合起來,以產生多個熒光的過濾器設置,可同時由多個熒光團的激發和發射觀察。過濾器組可從制造商,適合用于與兩個,三個,甚至在同一試樣的4個熒光團。多個過濾器組的主要問題是它們的費用和交叉或放氣,通過過量的發射熒光探針從一個發送用于另一個通過一個帶通區域時所發生的。在某些試樣(和過濾器集),具有顯著的滲色的背景上的強度和圖像的對比度的影響。許多研究者喜歡熒光圖像分別與優化過濾器集,隨后結合成一個復合的圖像。

                                                                先進的熒光技術通常需要使用一些與一個單一的二色鏡的激發和發射濾光片。為了方便這些調查,許多熒光顯微鏡都配有電動濾光輪或滑塊含有多達六個獨立的過濾器(參見圖8(C))。設計用來與滑塊的顯微鏡載用于插入滑塊的垂直照明專用插槽中,或可以被取代的過濾器的滑塊通常包含中性密度濾光片。排放滑塊也可以容納由垂直照明顯微鏡在某些設計中,或輔助中間管之間安裝的照明燈和觀察管,以容納滑塊。電動含有激發濾光片濾光輪單位一般都夾入垂直照明光學通路在直立和倒置顯微鏡之間的中性密度濾鏡和燈箱。同樣,被放置機動發射濾光片輪組件之間的垂直照明和目鏡觀察筒直立顯微鏡的設計,但通常通過相同的作為倒儀器的檢測器,用于外部端口連接。激發和發射滑塊和電動濾光輪單雙色鏡雙重和三重激發應用是非常有用的。省去重新定位過濾塊,同時觀察一個單一的標本,這些配件的圖像之間,使調查獲得準確的登記。

                                                                熒光顯微鏡的物鏡

                                                                在各種形式的反射光顯微鏡(包括熒光),圖像強度是物鏡的數值孔徑和放大倍率的函數。事實上,強度或亮度(定義為每單位面積的光子通量和時間)增加的數值孔徑的四次方,但只有放大倍率的平方成反比:

                                                                強度α(NA?OBJ4?/ M?2

                                                                其中,NA是物鏡的數值孔徑,M是放大倍率。很明顯,從這種關系中,最亮的熒光圖像,將被收集的高數值孔徑的物鏡和低倍率(如0.75/20x)。作為一個例子,一個60X的平場復消色差透鏡油浸物鏡數值孔徑為1.4理論上將產生更明亮的圖像相同的數值孔徑比100倍的物鏡,但也有權衡考慮。增加內部透鏡元件的數目(具有最高的數值孔徑物鏡)產生相應的增加的自發熒光強度減少從內部透鏡表面的反射。通常情況下,最高的校正因子和增加光傳輸之間的妥協是由制造商在他們的推薦物鏡,熒光顯微鏡。

                                                                在一般情況下,高數值孔徑的油(1.3?1.4)和(1.2)水浸泡平成熒光和平場復消色差的物鏡產生明亮的熒光圖像,因為其巨大的聚光能力。這些物鏡,顯示出優異的顏色校正,并且因此,能夠在同一平面上集中廣泛的熒光發射波長。的光傳輸特性的復消色差和螢石的物鏡是非常優秀到約350納米,用于檢查在紫外區(如DAPI,Hoechst公司的Alexa Fluor 350,和AMC)被激發的熒光染料的絕對要求。盡管有眾多的內部鏡片,這些物鏡從低熒光玻璃制成,帶防反射涂層,以盡量減少背景熒光和產量的圖像非常高的對比度。在觀察過程中的圖像的亮度也可以通過減少從標準的10倍下降到8倍或更低的目鏡倍率增加。

                                                                設計專門的應用程序的物鏡是廣泛使用的熒光顯微鏡。在這個類中,包括高數值孔徑的水浸泡,多浸漬(油,水,和甘油),和紫外線的物鏡有石英透鏡元件。對于活細胞成像應用,長工作距離的物鏡與校正鋌必要通過觀察厚(0.5-2毫米)培養瓶中墻。促進深厚標本內的考試物鏡,有一個很長的焦距(工作距離),這是可從幾個廠家的成像與蓋玻片通過空氣或水。長工作距離的設計,可以使用,不用玻璃蓋的水浸泡物鏡也有特氟隆的鼻錐,使得物鏡可以浸入水溶液。類似的物鏡產生的紫外線激發(340納米)的水,在20和30毫米之間(包括水約5毫米)的工作距離。對于相對低倍率的調查中,20倍水浸泡的物鏡具有非常高的數值孔徑(0.75?0.95)的建議。雖然挺貴的,這些物鏡產生極其明亮的圖像的熒光濃度和/或量子產率的情況下,邊際。

                                                                熒光顯微鏡配件

                                                                制造商正在不斷地生產有用的附加他們的儀器的輔助單位,以增加在熒光顯微鏡成像應用數量不斷增長的可用選項。例如,一個長方形的場站(見圖9),限制標本被照亮區域,以提高對比度和降低漂白,可作為一個選項在某些顯微鏡。取代傳統的光圈的垂直照明的視場光闌(一個可移動的模塊)的模塊化的視場光闌,并設計成與數字成像傳感器的高寬比相匹配。矩形區域停止科勒照明,提高了工作效率,并減少電子傳感器的信號對噪聲比。作為一個額外的好處,可以調整圖像的矩形大小,以配合舞臺步長時,采用可編程掃描卷積調查階段。針孔孔徑,坐落在的矩形區域停止類似的模塊,需要一個高度受限的照明領域的應用。

                                                                fluoromicro figure9

                                                                其他配件包括雙,使兩個光源(如汞和氙弧放電燈),同時連接到垂直照明燈的燈殼體適配器。適應激光激發的專業照明,也可應用,如全內反射熒光(TIRF),熒光壽命成像顯微鏡(FLIM),比成像,和漂白恢復實驗。此外,大多數的主要制造商所提供的研究級熒光顯微鏡容易地適應其各自的激光掃描共聚焦配件。直立接受激光共聚焦顯微鏡掃描單元通過三目觀察筒,而倒工具可以附加束掃描儀顯微鏡框的側面或后面港口。雙端口之間的垂直照明和觀察管插入引入額外的光源,或指示熒光多個檢測器可以是有用的。大多數單位都提供可選的C型安裝適配器或標準顯微鏡端口接頭。雙端口適配器也可用于同時從一激光源和電弧放電燈管外殼的后部的垂直照明的附加 ??光纖電纜。

                                                                熒光顯微鏡專為電的調查已經變得非常復雜。許多人都配有專門的振動衰減的階段,它可以接受顯微操縱器配件各種各樣的實驗中使用的熒光,紅外微分干涉對比(IR-DIC),和傳統的明場對比增強成像技術。搖擺物鏡轉盤使快速振動的自由交換的物鏡而成像的活細胞和組織,以防止干擾的標本或氣泡的侵入。熒光宏觀觀察生物體是可能的新高數值孔徑工作距離長,2x和4x微距鏡頭(物鏡),都配備了專門的過濾器組合塊。此外,一些制造商提供他們的體視顯微鏡配件熒光垂直照明器和過濾器集。

                                                                放大倍率為1.25倍至1.5倍,有時可在垂直照明作為一個選項,但只要有可能,應盡量避免使用輔助鏡頭由于引入空放大倍率熒光圖像的固有問題幾個模塊化垂直照明設計包括安裝分光器模塊包含多個相機接口上面的照明燈,以增加成像能力的規定。考慮到廣泛的電動配件現在可用熒光顯微鏡,包括nosepieces,聚光鏡,過濾輪,階段,調查比以往任何時候都更先進的成像技術。制造商設計配件施加一個顯著的大量的努力,許多是一次可能只用顯微鏡使用從各種來源的售后零件構成的復雜的熒光應用。由于熒光顯微鏡在細胞生物學,神經生理學,臨床上成為一個日益重要的工具,創新的新的顯微鏡配件的發展無疑將是一個持續的趨勢。

                                                                倒置熒光顯微鏡設計

                                                                垂直熒光照明的相似版本倒置顯微鏡支架(組織培養)。倒站還允許反射光的熒光和透射光顯微鏡不同的對比度增強技術的結合或交替之間。研究級倒置顯微鏡配有多個(最多6個)的輸入/輸出端口中,通常會與在框架的每一側上的單端口,以及一個或兩個端口(上部和下部)的后方和下方的基底部端口顯微鏡。在某些機型中,主圖像可以通過以下方式獲得的三個或更多個端口的同時,不使用中繼透鏡。這種級別的連接,可以使用多個光源,濾光輪,和攝像系統的復雜的熒光分析。含汞和氙lamphouses的倒置顯微鏡可與標準的多元素或以提高性能和減少紫外線和紅外光譜區的像差的非球面收藏家鏡頭。此外,廣泛的燈箱適配器可以用來附加一些照明光源,類似于直立式顯微鏡配件。

                                                                fluoromicro figure10

                                                                如圖10所示,是現代倒(組織培養)熒光顯微鏡配備了珀耳帖冷卻的CCD圖像傳感器和一個傳統的35毫米膠片相機系統的剖開示意圖。雖然膠片相機的用途有限,大多數倒置顯微鏡還包括這些附件的前線基地的下部的端口。在圖10中示出在顯微鏡使用安裝在柱子上的鎢鹵燈室可以執行傳統的明視野透射照明(有或沒有對比度增強)。汞或氙弧放電燈采用熒光顯微鏡使用專門配置的后端口連接到的反射光照明。隨著中性密度濾光片,透鏡光闌和視場光闌附近的端口進行訪問,在顯微鏡的后部。在一些倒置顯微鏡模型(未示出),一個L形的反射光照明含定心隔膜是可用以提高訪問額外的配件后輔助端口。通過顯微鏡光路在圖10中示出在黃色的未經過濾的弧光燈照明的透射光,紫色,綠色過濾的熒光激發,紅色熒光發射。

                                                                現代倒置顯微鏡幀,像他們的同行直立,計算機設計和制造復合材料結構和熱穩定性。此外,機械的階段的元件和電路結構的設計與短行程距離和高剛性,以避免在常規操作期間,如DIC棱鏡插入或調整的客觀校正鋌物鏡轉換器時,被操縱的俯仰和偏航。物鏡轉換器的高級階段是在時間的推移和長熒光觀測,能夠從根本上消除焦點漂移。其他階段選項不適用于標準的直立顯微鏡包括滑翔和360度旋轉的階段,玻璃舞臺嵌入板,加熱板,培養皿板持有人,和二氧化碳培養箱室。

                                                                倒置顯微鏡具有模塊化的設計可以很容易地被配置在電調查,體外受精,顯微操作,高分辨率的DIC,視頻增強的觀測,以及各種先進的熒光技術。共聚焦和多光子顯微鏡,工具也很容易適應。摩托配件包括百葉窗,過濾輪,旋轉物鏡轉盤,熒光塊塔樓,聚焦驅動器和聚光鏡。當加上先進的物鏡,可在工作距離長,水浸泡,紫外線激發,相襯,都具有高度的光學矯正,倒置顯微鏡進行熒光活細胞和組織的調查,是理想的工具。

                                                                結論

                                                                在熒光顯微鏡中,試樣內的本地化的熒光基團的濃度之間的巨大差異,從一個不同的消光系數和量子產率的熒光染料耦合到另一個,對于一個給定的量,激發光強度產生顯著影響發射信號。這些綜合因素考慮,許多標本中只有極少量的熒光材料在任何特定的視場,產生的熒光發射是四到六個數量級小于激發光強度的平均電平 ??。此外,一些更復雜的熒光技術,如原位雜交和共振能量轉移(FRET),有發射信號的強度,范圍可以9至10個數量級小于激發。為了彌補這些大的激發和發射的強度差異,現代的熒光顯微鏡必須能夠激發照明水平超過10億次,而不會干擾的熒光信號衰減。

                                                                在熒光顯微鏡的主要屬性是較高的特異性熒光探針的吸收和發射特征波長的光,導致該技術能夠在非常低的濃度,在復雜的混合物中選擇性地檢測物鏡物質。此外,高靈敏度和空間分辨率的熒光被精確定位,并研究了在長度尺度下方的光學顯微鏡的分辨率,使單分子。本地化的環境因素的影響也非常重的熒光發射,因此該方法是一種理想的pH值,粘度,離子濃度,分子的距離和方向,膜電位,疏水性,電荷分布和擴散系數的波動探針。的時間分辨率熒光激發的熒光探針,它可以是納秒量級的壽命是有限的。由于許多生物過程發生在這個時間域,衰減動力學可以揭示細胞過程的動態信息。兩者統稱,這些因素在熒光顯微鏡的應用是至關重要的細胞生物學。

                                                                熒光顯微鏡已經進化驚人的速度在過去的十年中,激光技術的發展同樣迅速,固態探測器,干擾薄膜制造,和基于計算機圖像分析。發展高數值孔徑的水浸泡物鏡進一步協助調查的生物現象,讓研究者深入探究在自然環境中在活細胞內。隨著顯微鏡制造商應對不斷變化的需求的研究社區,先進的的熒光儀器和配件的發展將毫無疑問地繼續,他們最終的貢獻,探索大自然的奧秘最終可能有著深遠的意義。



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