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                                                                尼康顯微鏡:顯微物鏡的屬性

                                                                2019-06-12 19:12:25 129

                                                                三個關鍵的設計特點的物鏡顯微鏡的極限分辨率極限。這些包括用來照亮試樣的孔徑角的光錐物鏡捕獲,和對象空間中的物鏡前透鏡和被檢體之間的折射率的光的波長。

                                                                properties figure1

                                                                圖1中顯示的是通過一個簡單的雙透鏡的阿貝聚光照明顯微鏡的物鏡的剖開圖。光通過聚光鏡被組織成一個光錐到樣品上發出,然后被發送到物鏡前透鏡元件作為反錐形。照明錐的大小和形狀是一個函數的組合的物鏡和聚光鏡的數值孔徑物鏡的孔徑角是由希臘字母θ表示,將在下面詳細討論。

                                                                的分辨率衍射極限的光學顯微鏡的最小可檢測兩個緊密間隔的樣本點之間的距離可以被描述為

                                                                R =λ/2n(SIN(θ))

                                                                式中,R是分開的距離,λ是照射波長,n的成像介質折射率,θ是物鏡的孔徑角的二分之一。檢查方程中,很明顯的,分辨率是成正比的照明波長。人的眼睛與在400和700納米之間,它表示利用顯微鏡觀察的大多數在可見光光譜的波長區域。分辨率也取決于成像介質的折射率和物鏡的孔徑角。物鏡旨在圖像標本與空氣或前透鏡和試樣之間的介質的折射率越高。往往是相當有限的視場,和前透鏡元件的物鏡是放置在靠近試樣與它必須位于光學接觸。一個增益由約1.5倍的分辨率達到浸油取代的作為成像介質為空氣。

                                                                最后,但也許是最重要的因素,確定一個物鏡的分辨率是角的光圈,其中有一個實際的上限約72度(與一個正弦值0.95)。結合使用時的折射率,該產品

                                                                N(SIN(θ))

                                                                數值孔徑(簡稱NA為已知的,對于任何特定的物鏡的分辨率提供了一個方便的指標。數值孔徑一般是最重要的設計標準(除倍率)時要考慮選擇一個顯微鏡物鏡。值的范圍從0.1非常低倍率物鏡(倍到4倍),以盡可能1.6高性能的物鏡,利用專門的浸泡油。由于數值孔徑值增加了一系列的物鏡,相同的放大倍率,我們通常觀察到一個更大的聚光能力和提高分辨率。顯微鏡應仔細選擇一個物鏡的數值孔徑相匹配的放大倍率,在最終圖像中產生。在最好的情況下,應充分擴大只是解決的細節,被視為與舒適,但到如此地步,不空倍率阻礙精細標本細節的觀察。

                                                                正如在顯微鏡的照明的亮度是由聚光鏡工作的數值孔徑的平方,由物鏡產生的圖像的亮度,是由它的數值孔徑的平方。此外,物鏡放大倍率也發揮了作用,在確定圖像的亮度,這是橫向放大率的平方成反比。數值孔徑的平方/倍率表示的物鏡,當利用透射照明的聚光能力。因為高數值孔徑物鏡往往是更好的像差糾正,他們還收集更多的光線,產生出更明亮,校正后的圖像高度解決。應該指出的是,圖像的亮度迅速降低,提高放大率。在光線水平的情況下,是一個限制因素,選擇一個物鏡的數值孔徑最高,但具有最低放大倍率能夠生產足夠的分辨率。

                                                                在裝配過程中的物鏡,鏡頭是第一戰略間隔一圈坐在進入細胞坐騎,然后打包成一個中央套筒油缸內部安裝的物鏡桶。個別鏡頭安裝鏡頭紡紗在精密車床夾頭,其次是鏡頭鎖定到位(或透鏡組)用薄的金屬邊緣拋光黃銅肩靠在。球面像差進行校正,通過選擇最佳的間隔物,以適應在較低的兩個鏡頭支架(半球形和彎月形透鏡)之間。該物鏡偏光向上或向下翻譯整個鏡頭群內套筒鎖緊螺母,使安置物鏡的倍數的物鏡轉換器可以互換不失焦。昏迷調整完成與三個中心螺釘,可以優化內部透鏡組的位置相對于光軸的物鏡。

                                                                物鏡規格放大
                                                                消色差校正
                                                                放大 數值孔徑 工作距離(mm)
                                                                4倍 0.10 30.00
                                                                10倍 0.25 6.10
                                                                20倍 0.40 2.10
                                                                40倍 0.65 0.65
                                                                60X 0.80 0.30
                                                                100×(油) 1.25 0.18
                                                                消色差校正
                                                                放大 數值孔徑 工作距離(mm)
                                                                0.5倍 0.02 7.00
                                                                1倍 0.04 3.20
                                                                2倍 0.06 7.50
                                                                4倍 0.10 30.00
                                                                10倍 0.25 10.50
                                                                20倍 0.40 1.30
                                                                40倍 0.65 0.57
                                                                50倍(油) 0.90 0.40
                                                                100倍(油) 1.25 0.17
                                                                40倍 0.65 0.48
                                                                100倍 0.90 0.26
                                                                平常螢石校正
                                                                放大 數值孔徑 工作距離(mm)
                                                                4倍 0.13 17.10
                                                                10倍 0.30 16.00
                                                                20倍 0.50 2.10
                                                                40倍 0.75 0.72
                                                                40倍(油) 1.30 0.2
                                                                60倍 0.85 0.3
                                                                100倍(干) 0.90 0.30
                                                                100倍(油) 1.30 0.20
                                                                100倍(油??虹膜) 0.5-1.3 0.20
                                                                平常復消色差校正
                                                                放大 數值孔徑 工作距離(mm)
                                                                2倍 0.10 8.50
                                                                4倍 0.20 15.70
                                                                10倍 0.45 4.00
                                                                20倍 0.75 1.00
                                                                40倍 0.95 0.14
                                                                40X(油) 1.00 0.16
                                                                60X 0.95 0.15
                                                                60X(油) 1.40 0.21
                                                                60X?
                                                                (水浸泡)
                                                                1.20 0.22
                                                                100×(油) 1.40 0.13
                                                                100X(油??NCG) 1.40 0.17
                                                                NCG =無蓋玻片
                                                                表1

                                                                有是物鏡桶上刻了豐富的信息。簡單地說,每一個物鏡上登記的倍率(例如10倍,20倍或40倍等),其物鏡旨在給出最好的圖像(通常為160毫米或希臘的無窮大符號)管長和厚度覆蓋玻璃保護標本,這是假設在校正球面像差(通常為0.17毫米),有一個恒定的值由設計者。如果物鏡被設計成一滴油和標本之間,物鏡上會刻上油或OEL或HI(同質浸泡)。后者指定這些在物鏡上不刻的情況下,物鏡上意味著要使用干燥,空氣的最低部分的物鏡和標本之間。物鏡還經常隨身攜帶雕刻的數值孔徑(NA)值。這可能會有所低倍率物鏡從0.04至1.3或1.4為高功率油浸復消色差的物鏡。如果沒有指定物鏡進行更高的修正,通常可以假設它是一個消色差物鏡。更高度糾正的物鏡有銘文,如復消色差透鏡或APO,FL,平常氟等舊的物鏡,往往焦距(鏡頭到圖像的距離),上刻桶,這是一個衡量的放大倍率。在現代顯微鏡,其物鏡是設計為特定的光管的長度,因此包括在***管上的焦距和放大倍率變得有些多余。

                                                                表1列出了工作距離和數值孔徑作為功能的倍率四種最常見的類物鏡:消色差透鏡,平常消色差透鏡,平常螢石,平常復消色差。需要注意的是干的物鏡都具有用于液浸介質的數值孔徑小于1.0,唯一的物鏡設計值,超過此值的數值孔徑。

                                                                當制造商的集匹配的物鏡,例如,各種放大倍率(單表1中列出的物鏡子集)的所有消色差的物鏡,被安裝在物鏡轉換器上,他們被通常設計投影約在相同的平面在體內的圖像管中。因此,改變物鏡旋轉物鏡轉換器通常只需要極少使用微調旋鈕重新建立大家關注的焦點。這樣的一組物鏡被描述為是齊焦,一個有用的便利性和安全功能。符合條件的物鏡集的設計也是預定心,從而使視場中的一個物鏡為中心的標本時,仍然為中心旋轉物鏡轉換器帶來的另一個物鏡,使用。

                                                                多年來,大多數廠家的生物應用設計的物鏡都符合國際標準齊焦距離因此,大多數的物鏡有一個齊焦距離為45.0毫米,并且被認為是可以互換的。一組新的設計標準隨著遷移到無限遠校正的管長度,出現在物鏡與鏡筒透鏡的像差校正。加上需求增加更大的靈活性,以適應需要越來越大的工作距離與更高的數值孔徑和視場大小,物鏡來自不同制造商之間的互換性消失。這種轉變體現現代尼康CFI-60光學系統,具有“無鉻”的物鏡,管鏡頭和目鏡沒有一個被利用,以實現校正另一個單獨校正的CFI-60系統中的每個組件。管子的長度設置為無窮大(平行光路)使用的管透鏡,已增加至60毫米的齊焦距離。即使物鏡安裝螺紋尺寸已經改變從20.32至25毫米的光學系統,以滿足新的要求。

                                                                properties figure2

                                                                在用光學顯微鏡的視場直徑所表示的字段的視圖數或簡單的視場數,這是視的直徑以毫米為單位表示,并在中間像平面測量。在對象(檢體)的場直徑平面上變為視場數除以物鏡的放大倍數。雖然視場數的放大倍率和眼(目鏡)視場光闌的直徑往往是有限的,有明確的限制,這也是所施加的設計的物鏡。早在顯微鏡物鏡是有限的,最大的可用場直徑約18毫米(或相當少的高倍率目鏡),但現代的平場復消色差和其他專門的平場物鏡的范圍可以在22毫米和28毫米之間往往有一個可用場結合大視野目鏡。不幸的是,有用的字段的最大數目一般不刻在物鏡桶,也沒有廣泛顯微鏡目錄中列出的。

                                                                沒有任何明顯的濃度變化在圖像銳度的軸向范圍內,通過該物鏡可以集中被稱為景深此值從低到高數值孔徑物鏡根本變化,通常隨數值孔徑的增加(見表2和圖2)。在高數值孔徑,主要取決于波光學景深,而在較低的數值孔徑,幾何光學“的錯亂圓圈”占主導地位。字段的總深度由下式給出的波和幾何光學景深的總和

                                                                e?TOT?=λN/ NA?2?+(N / M×NA)é

                                                                其中,λ是波長的照明,?成像介質的折射率,NA是物鏡的數值孔徑?M?是物鏡的橫向放大率,?鍵是最小的距離,就可以解決由一個檢測器,其被放置在圖像平面的物鏡。請注意,衍射限制的景深(方程的右手側的第一項)縮小與數值孔徑的平方成反比,而與第一功率的數值孔徑的分辨率降低的橫向限制。其結果是,由系統的數值孔徑更軸向分辨率和光學部分的厚度的影響比在顯微鏡的橫向分辨率(見表2)。

                                                                最接近的表面的玻璃蓋和物鏡前透鏡的間隙之間的距離被稱為工作距離在試樣的情況下被設計成沒有蓋玻璃成像,工作距離的測量是在實際的試件表面。一般來說,工作距離減小了一系列的匹配物鏡的放大倍數和數值孔徑的增加(見表1)。可以查閱標本作為成像介質與空氣的物鏡應該工作距離盡可能長的時間,數值孔徑的要求得到滿足。浸沒物鏡,另一方面,應該有較淺的工作距離,以包含前透鏡之間的浸沒液體和試樣。許多設計物鏡有密切的工作距離有一個彈簧加載的回縮塞,允許前置鏡頭組件縮回推到物鏡的身體和扭曲,將其鎖定到位。物鏡是旋轉物鏡轉換器,所以它不會拖累整個表面的干凈的玻片浸油這種配件是方便的。在相反的方向扭動回縮止動件釋放的透鏡組件的使用。在一些應用中(見下文)中,很長的自由工作距離是不可缺少的,和特殊的物鏡是用于這樣的用途而設計的,盡管在實現大的數值孔徑和光學矯正的必要程度的困難。

                                                                properties figure3

                                                                物鏡設計的一個最顯著的進步,在最近幾年的是,這有助于降低時出現的光穿過透鏡系統的不希望的反射的防反射涂層技術的改善。每個未包衣的空氣 - 玻璃界面能反映4%和5%之間,垂直于表面的入射光束,從而在垂直入射時的透射率值的95-96%。四分之一波長厚的具有適當折射率的抗反射涂層的應用可以增加這個值由三至百分之四。物鏡變得更復雜的透鏡元件的數量不斷增加,需要消除內部反射,相應增長。一些現代的具有高度校正的物鏡可以包含多達15個鏡頭有許多空氣 - 玻璃界面的元素。如果鏡片涂層,反射損耗僅軸向光線透過率值將下降到50%左右。單層一次利用透鏡涂層,以減少眩光和提高傳輸產生的傳輸在可見光譜范圍內的值超過99.9%的多層涂層,現在已經取代了。

                                                                場的深度和圖像深度
                                                                放大 數值
                                                                孔徑
                                                                景深
                                                                (微米)
                                                                圖像深度
                                                                (毫米)
                                                                4倍 0.10 15.5 0.13
                                                                10倍 0.25 8.5 0.80
                                                                20倍 0.40 5.8 3.8
                                                                40倍 0.65 1.0 12.8
                                                                60倍 0.85 0.40 29.8
                                                                100倍 0.95 0.19 80.0
                                                                表2

                                                                圖3中所示的光波反射和/或通過涂有防反射層的透鏡元件的示意圖。入射波取得的第一層以一定角度在圖3中的層A),產生的光的一部分被反射(R(鄰))的一部分被傳輸通過所述第一層。遇到的第二防反射層(B層,在相同的角度的光的另一部分被反射,并從第一層反射的光干擾。一些其它光波繼續到玻璃表面上,在那里再次反射和透射。從玻璃表面的反射光干擾(和相消)與防反射層反射的光。防反射層的折射率的玻璃和周圍介質(空氣)的變化。由于光波通過的防反射層和玻璃表面,大部分的光(取決于入射角-通常的光學顯微鏡中的透鏡法線)最終透過玻璃集中以形成圖像。

                                                                氟化鎂是一種利用薄層的光學增透膜的許多材料,但現在大多數顯微鏡制造商生產自己的專利配方。總的結果是在對比度和可見光波長的傳輸并發的破壞性干擾,在位于傳輸頻帶之外的頻率諧波相關的顯著改善。這些專門的涂料可以由操作不當容易損壞和顯微鏡應該意識到這個漏洞。防反射多層膜有一個稍微偏綠色調,而不是單層涂層的略帶紫色的色調??,觀察,可以被用來區分涂料。內部鏡片上使用減反射膜的表面層往往比相應的涂層設計,以保護外部鏡片表面柔和得多。清潔光學表面已經涂有薄膜,特別是如果在顯微鏡已被拆解和內部鏡頭元件受到審查時,應采取非常謹慎。

                                                                properties figure4

                                                                被定義為從透鏡中心的距離平行光線的光軸上(通常被稱為主要的焦點集中到一個點的透鏡系統的焦距被稱為主要焦點的假想平面垂直于透鏡系統焦平面的。每一個鏡頭有兩個主要的焦點為光進入每邊,一個在前面,一個在后面。按照慣例,被稱為前焦面更靠近所述前透鏡元件的物鏡焦平面和焦平面位于后面的物鏡被稱為后側焦點面(參見圖4)。后側焦點面的實際位置的變化與物鏡建設,但一般是位于高倍率物鏡的物鏡桶內部的某個地方。低倍率的物鏡往往有一個外部桶,坐落在線程區域或顯微鏡物鏡轉換器內的后焦平面。

                                                                由于光線通過一個物鏡物鏡的,它們被限制由后孔或出射光瞳的物鏡,如在圖4中示出。這個光圈的直徑12毫米低倍率物鏡之間下降到約5毫米,最高權力的復消色差物鏡。光圈大小是非常關鍵的外延照明應用,依靠物鏡上充當成像系統和聚光鏡,出瞳也成為入瞳。的圖像的光源必須完全填滿整個視場的物鏡后孔徑,以產生均勻的照明。如果光源圖像比孔徑小,視場照度不均勻的體驗暗角。另一方面,如果光源的圖像大于后孔,一些光不進入物鏡的照度降低。



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