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                                                                奧林巴斯顯微鏡:物鏡的數值孔徑和分辨率

                                                                2019-06-12 19:12:08 296

                                                                顯微鏡物鏡數值孔徑是其收集光并解決細標本細節在一個固定的物體距離的能力的量度。圖象形成光波穿過試樣和在倒置錐體進入物鏡,如圖1這個錐形光的縱向切片顯示了孔徑角,是由物鏡的焦距確定的值。

                                                                μ是二分之一的數值孔徑角(A),它與通過以下等式的數值孔徑

                                                                數值孔徑?(NA)?= n(sin μ)

                                                                其中n是物鏡的前透鏡和試樣玻璃蓋,一個值,該范圍為1.00空氣1.51專門浸沒油之間的成像介質折射率。許多作者替換變量αμ在數值孔徑方程。從這個等式很明顯,當成像介質為空氣(具有折射率,n= 1.0),則數值孔徑僅取決于所述角μ的最大值為90°。角度的sin μ,因此,具有1.0(SIN(90°)= 1),這是一個透鏡與空氣作為所述成像介質操作的理論最大數值孔徑(使用“干”顯微鏡物鏡)的最大值。

                                                                在實踐中,但是,它是很難實現的數值孔徑值在0.95以上的干的物鏡。圖2示出了一系列從變焦距和數值孔徑的物鏡衍生光錐。作為光錐改變,角度μ從7°的增加在圖2(a)至圖2的(c)60°,從而增加了數值孔徑從0.12至0.87,接近極限時空氣是成像媒介。

                                                                通過檢查數值孔徑方程,很明顯的是,折射率是在實現數值孔徑大于1.0的限制因素。因此,為了獲得較高的工作數值孔徑,物鏡的前透鏡和試樣之間的介質的折射率必須增加。顯微鏡物鏡,現已允許成像在其他媒體,如水(折射率= 1.33),甘油(折射率= 1.47),和浸油(折射率= 1.51)。護理應與這些物鏡可用于防止當一個物鏡是,使用具有比它的物鏡是為不同的浸沒介質,這將產生不希望的偽影。我們建議顯微鏡從來不使用專為油浸無論是與甘油或水的物鏡,雖然有幾個新的物鏡,最近已經******,將與多個介質。您應與制造商檢查是否有任何疑慮。

                                                                多數物鏡在60倍和100倍(或更高版本)的放大倍率范圍是設計用于浸油的使用。通過檢查上面的數值孔徑方程,我們發現,最高理論數值孔徑與浸油獲得的是1.51(當sinμ)= 1)。在實踐中,然而,大多數的油浸物鏡的1.4的最大數值孔徑,以最常用的數值孔徑范圍為1.0至1.35。

                                                                物鏡的數值孔徑也依賴,在一定程度上,在校正光學像差的量。高度校正的物鏡趨于如示于下表1中有大得多的數值孔徑為各個放大倍數。如果我們采取了一系列典型的10倍物鏡作為一個例子,我們看到,平場校正的規劃物鏡,數值孔徑增加對應校正色差和球面像差平場消色差,NA = 0.25;?平場螢石,NA = 0.30;?并平場復消色差透鏡,NA = 0.45。

                                                                物鏡的數值孔徑
                                                                放大 平場
                                                                消色差
                                                                (NA)
                                                                平場
                                                                螢石
                                                                (NA)
                                                                平場
                                                                復消色差透鏡
                                                                (NA)
                                                                0.5X 0.025 不適用 不適用
                                                                1X 0.04 不適用 不適用
                                                                2倍 0.06 不適用 0.10
                                                                4倍 0.10 0.13 0.20
                                                                10倍 0.25 0.30 0.45
                                                                20倍 0.40 0.50 0.75
                                                                40倍 0.65 0.75 0.95
                                                                40倍(油) 不適用 1.30 1.00
                                                                60X 0.75 0.85 0.95
                                                                60倍(油) 不適用 不適用 1.40
                                                                100X(油) 1.25 1.30 1.40
                                                                150倍 不適用 不適用 0.90
                                                                表1

                                                                增加數值孔徑橫跨越來越光學校正因子在一系列類似倍率物鏡的該特征保持在整個放大率范圍內真如表1所示。大多數制造商努力,以確保它們的物鏡具有最高校正和數值孔徑是可能每個類的物鏡。

                                                                的顯微鏡物鏡的分辨率定義為在該仍然可以區分為兩個獨立的實體的檢體的兩個點之間的最小距離。分辨率是顯微鏡,因為在高放大倍率,圖像可能會出現不清晰的,但仍然有點主觀的價值被解析為物鏡的最大能力。數值孔徑確定一個物鏡的分辨能力,但在顯微鏡系統的總的分辨率也取決于臺下聚光鏡的數值孔徑時。較高的總系統的數值孔徑,更好的分辨率。

                                                                顯微鏡光學系統的正確對準是非常重要的還有,以確保最大的分辨率。臺下聚光鏡必須匹配于物鏡相對于數值孔徑和調整孔徑光闌為準確的光錐的形成。用于圖像中的檢體的光的波長光譜也是第一個決定性因素。較短的波長是能夠解決的細節在更大程度的比是在較長的波長。有已被衍生表達的數值孔徑,波長,和分辨率之間的關系數方程

                                                                R =λ/ 2NA (1)
                                                                R =0.61λ/ NA (2)
                                                                R =1.22λ/(NA(OBJ)+ NA(cond)) (3)

                                                                其中,R是分辨率(兩個對象之間的最小可分辨的距離),NA等于數值孔徑,λ等于波長,NA(OBJ)等于物鏡的數值孔徑,及NA(cond是聚光的數值孔徑。注意,等式(1)(2)相差倍增因子,這是0.5等式(1)和0.61等式(2)?。這些方程是基于許多因素(包括各種光學物理學家制成理論計算的)來解釋的物鏡和聚光鏡的行為,而不應被認為是任何一個一般物理定律的絕對值。在一些情況下,如共焦和熒光顯微鏡,分辨率實際上可能超過置于由這三個方程中的任何一個的限制。其他因素,如低標本對比度和不當照明可用于較低的分辨率,并且更經常的情況是,對現實世界的最大值R(約0.25?微米的使用550納米的中間光譜的波長),以及數值孔徑1.35 1.40沒有體現在實踐中。表2提供的列表分辨率(R)和數值孔徑(NA)由物鏡放大倍率和糾正。

                                                                分辨率和數值孔徑
                                                                由物鏡類型

                                                                物鏡型號

                                                                平場消色差 螢石平場 平場復消色差透鏡
                                                                放大 不適用 分辨率
                                                                (微米)
                                                                不適用 分辨率
                                                                (微米)
                                                                不適用 分辨率
                                                                (微米)
                                                                4倍 0.10 2.75 0.13 2.12 0.20 1.375
                                                                10倍 0.25 1.10 0.30 0.92 0.45 0.61
                                                                20倍 0.40 0.69 0.50 0.55 0.75 0.37
                                                                40倍 0.65 0.42 0.75 0.37 0.95 0.29
                                                                60X 0.75 0.37 0.85 0.32 0.95 0.29
                                                                100X 1.25 0.22 1.30 0.21 1.40 0.20
                                                                NA =數值孔徑
                                                                表2

                                                                當在顯微鏡是在完美對準,并具有與臺下聚光鏡適當匹配的物鏡,那么我們就可以代替物鏡的數值孔徑成方程(1)(2)?,與添加的結果是等式(3)簡化為方程式(2)?。要注意的一個重要的事實是,倍率不會顯示為在任何這些方程的一個因素,因為只有數值孔徑和照明光的波長確定樣品分辨率。正如我們所提到的(并且可以在公式中看到)的光的波長是在顯微鏡的分辨率的一個重要因素。更短的波長,得到較高的分辨率(對于較低值?),反之亦然。在光學顯微鏡的最大分辨能力實現了與近紫外光,最短有效成像波長。近紫外光之后是藍色,然后綠色,最后紅光在解決標本細節的能力。在大多數情況下,顯微鏡使用由鎢-鹵素燈泡產生白光照亮樣品。可見光譜的中心位于約550納米,對于綠色光的主波長(我們的眼睛最敏感的綠色光)。它是該波長被用來計算在表2中的數值孔徑值分辨率值也是在這些方程和更高的數值孔徑重要也將產生更高的分辨率,可明顯看出在表2中的光的波長的效果上的分辨率,在一個固定的數值孔徑(0.95),列于表3。

                                                                分辨率與波長
                                                                波長
                                                                (納米)
                                                                分辨率
                                                                (微米)
                                                                360 0.19
                                                                400 0.21
                                                                450 0.24
                                                                500 0.26
                                                                550 0.29
                                                                600 0.32
                                                                650 0.34
                                                                700 0.37
                                                                表3

                                                                當光從各點的試樣的通過物鏡,并重組為一個圖像時,各點的試樣的出現在圖像的小圖案(未分)被稱為在艾里模式。這種現象是通過衍射或光散射引起,因為它穿過微小零件和間隔在試樣和物鏡的圓形回光圈。艾里模式的中央最大常被稱作艾里斑,它被定義為通過所述第一最小值的艾里圖案包圍的區域,并且包含的光能量的84%。這些艾里磁盤組成的小同心輕和黑眼圈如示于圖3本圖顯示艾里磁盤及其強度分布作為間隔距離的函數。

                                                                圖3(a)示出一個假想艾里斑,基本上由包含中央最大的衍射圖案的(通常稱為零階最大值)由同心第一,第二,第三等,依次遞減的亮度順序最大值構成包圍的強度分布。兩個艾里磁盤和在光學分辨率的極限它們的強度分布示于圖3(b)中。在這一部分圖中,在兩個盤之間的間隔超過其半徑,并且它們是可解析的。在其中兩個艾里磁盤可以拆分成單獨的實體的限制通常被稱為瑞利判據。如圖3(c)示出了兩個艾里磁盤和在一個情況下的零階最大值之間的中心到中心的距離小于這些最大值的寬度的強度分布,和兩個盤都不能單獨解析的瑞利判據。

                                                                在由物鏡在形成圖像,即變為可見的樣本的更詳細投射的艾里磁盤小。更高的校正(螢石和apochromats)的物鏡產生較小的艾里磁盤比更低的修正物鏡。以類似的方式中,具有較高的數值孔徑的物鏡也能夠產生更小的艾里磁盤。這是高數值孔徑和總校正光學象差的物鏡所用的檢體區分更精細的細節的首要原因。

                                                                圖4示出的數值孔徑的上成像的一系列相同焦距的假想物鏡艾里磁盤的大小的影響,但不同的數值孔徑。具有小數值孔徑的艾里斑的大小是大的,如圖4(a)中。作為數值孔徑的一個物鏡增加,并且光錐角然而,該艾里斑的大小減小,如圖4(b)和圖4(c)所示。在目鏡膈肌水平產生的圖像實際上是艾里磁盤這是我們所認為的光明與黑暗的馬賽克。其中,兩個磁盤過于靠近在一起,使得它們的中心斑點重疊很大,由這些重疊磁盤表示的兩個細節都沒有解決或分離并因此顯示為一個,如在圖3中所示的上方。

                                                                在圖像形成理解一個重要的概念是由物鏡截獲衍射光線的性質。僅在較高的(第一,第二,第三等)衍射光的訂單被捕獲的情況下,可以干擾工作重新創建在所述物鏡的中間像平面的圖像。當只有零階光線被捕獲,這幾乎是不可能重構樣品的一個可識別圖像。當一階的光線被添加到零階射線,圖像變得更加連貫,但它仍然缺乏足夠的細節。只有當高階射線復合,該圖象將表示檢體的真實結構。這是基礎的大數值孔徑(以及隨后的更小的艾里磁盤)的必要性,以實現高清晰度的圖像,用光學顯微鏡。

                                                                在一天到一天的例行觀察,大多數顯微鏡不要試圖達到的最高分辨率圖像可能與他們的設備。它只有在專門情況下,例如高倍率明場,熒光DIC共聚焦顯微鏡,我們力爭達到顯微鏡的限制。在顯微鏡的大多數用途,這是沒有必要使用高數值孔徑的物鏡,因為檢體容易地解決了與使用較低數值孔徑物鏡。這是特別重要的,因為高數值孔徑和高放大倍數都伴隨著場的很淺的深度(這指的是良好的聚焦在區域正下方或者只是區域上方被檢查)和短工作距離的缺點。因此,在標本,其中分辨率是不太關鍵的和放大倍率可以更低,最好是用溫和的數值孔徑較低倍物鏡以得到具有多個工作距離和更多的景深圖像。

                                                                臺下聚光鏡孔徑光闌的仔細定位也以數值孔徑和濫用此隔膜可導致圖像劣化(如上一節中所討論的控制臨界臺下聚光鏡)。其他因素,例如對比度和照明的效率,也影響圖像分辨率的關鍵要素。




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