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                                                                尼康顯微鏡:德塞拿蒙偏置遲緩DIC顯微鏡

                                                                2019-06-12 18:53:33 78

                                                                在傳統的微分干涉差顯微鏡DIC)的系統設計,偏置相位差引入到翻譯的匹配(聚光鏡和物鏡)利用諾馬斯基或改性Wollaston棱鏡整個顯微鏡的光軸產生一個恒定的光程差的光學列車。也可以實現同樣的效果可以通過一個固定的諾馬斯基棱鏡系統中的應用和四分之一波長的相位差板與偏振器或分析儀一起組成的一個簡單的Sénarmont補償。

                                                                de senarmont intro figure1

                                                                尼康Eclipse E600顯微鏡系列圖1所示基本Sénarmont的配置為一體的現代化,直立研究工具。的偏振片和四分之一波長相位差板相結合,與主要的光端口中的顯微鏡底座上的固定螺絲固定到機殼。一旦固定到適當的位置,所述相位差板被保持在預先設定的取向,而偏振器可以旋轉90度(加或減45度),繞光軸的顯微鏡。根據不同的方向相對于相位差板的偏振器,Sénarmont補償照亮以線性,橢圓形,或圓偏振光顯微鏡的光學列車。

                                                                極化波前先退出的de Sénarmont補償遇到固定諾馬斯基的棱鏡在顯微鏡聚光器轉盤(見圖1),其后重新導向,剪切產生振動方向正交分量(普通非凡的眼波)45度角的新興從Sénarmont補償偏振光。的聚光透鏡系統聚焦成并行組件和項目到試樣剪切的波陣面。收集離開標本的光由物鏡聚焦到位于顯微鏡物鏡轉換器安置在一幀中的第二固定利用諾馬斯基棱鏡干涉平面。物鏡利用諾馬斯基棱鏡,這是相匹配的聚光鏡棱鏡和反轉,重新組合成同軸的正交分量的剪切的波陣面。雖然直線偏振光出射的光的物鏡利用Nomarski棱鏡被阻止由分析儀,橢圓形,圓偏振光可以通過組件通過以形成圖像的標本。

                                                                微分干涉對比顯微鏡首次提出并設計了由弗朗西斯·史密斯于1955年,誰建立了一個修改后的偏光顯微鏡沃拉斯頓棱鏡加入到前焦平面聚光鏡和后焦平面的物鏡。由于其設計上的局限性,沃拉斯頓棱鏡隨后更換了更先進的系統,介紹法國科學家喬治諾馬斯基,使棱鏡聚光鏡和物鏡孔徑共軛平面一段距離的物理位置。這個改進允許標準顯微鏡的光學元件的使用在現代DIC系統,目前享有廣泛的應用。

                                                                在相襯類似的方式中,是非常有用的可視化活細胞等透明,未染色的標本,否則難以觀察到,在使用全孔徑和分辨率的顯微鏡的光學系統的傳統的明照明DIC的顯微鏡。然而,DIC不患暈文物蒙面孔相襯光學固有,并有能力生產出優秀的圖像比較厚的標本。此外,DIC圖像可以很容易地操作使用數碼相機和錄影成像技術,以進一步增強對比度。

                                                                de senarmont intro figure2

                                                                微分干涉對比效果通過轉換梯度的函數在試樣為振幅(強度,如在圖2中示出)的光路長度的差異,可以在顯微鏡目鏡(或記錄在膠片上或數字)的對比度改善可視化。在試樣的光路長度的主要決定因素是檢體及其周圍介質中,剪切的波陣面的光路上的兩點之間經過的幾何距離之間的折射率差。DIC的光學系統產生的圖像有一個獨特的陰影鑄件的外觀和顯示偽三維,如果他們被照明從一個高度傾斜光源,從一個單一的方位角。一般,DIC是有用的,確定的方向相梯度利用充分物鏡光圈產生薄的光學切片標本,沒有超越眼前的焦平面定位的模糊干擾。

                                                                沃拉斯頓和諾馬斯基棱鏡

                                                                在微分干涉顯微鏡的關鍵要素進行匹配沃拉斯頓雙折射和/或利用Nomarski棱鏡,顯微鏡光學路徑插入在一個45度角的偏振器和分析器(西北向東南)與剪切軸導向。渥拉斯頓棱鏡的兩個精密研磨和拋光的石英具有的光軸的垂直方向的楔形板的構造,上面的斜邊膠合在一起,產生一個光學各向異性的復合板。事變線性極化波前進入一個的沃拉斯頓棱鏡(面向在一個45度角棱鏡光學軸)被分成兩個獨立的正交波,稱為普通和特殊波。

                                                                因為它們是來自單個源的局部化區域(通常,鎢鹵素燈的燈絲),由渥拉斯頓棱鏡產生的正交波陣面是一致的,具有相同的幅度,并在同一方向傳播,通過下部的棱鏡楔(參見圖3(a))。普通波通過棱鏡在垂直于光軸的方向上行進,而異常波的軸線平行地定向。此外,沿著這些垂直的軸不同的介電性能,產生一個行波通過棱鏡在更高的速度比其他。普通波通過棱鏡所得沿的快軸(具有低的折射率),并的異常波遍歷速度較慢的軸線(較高的折射率)。

                                                                de senarmont intro figure3

                                                                膠結石英楔的折射率之間的交界處,發生的波陣面的角度分割或剪切,從而在空間上分開的剪切角定義為一個角度的波此外,波陣面棱鏡楔邊界交換身份,與普通波成為非凡波,反之亦然。整個棱鏡的所有事件的波陣面的剪切角度和分離的距離是恒定的,而不管該表項的點,是指由棱鏡剪切軸方向的波陣面的剪切此軸位于縱向平面的Wollaston棱鏡,低級石英楔子的光軸平行的方向。在一般情況下,由渥拉斯頓棱鏡(或利用Nomarski)產生的剪切距離小于千分尺,使沒有可觀察到的光束分離發生在從棱鏡射出。

                                                                所經歷的普通和特殊的波陣面的結果,在兩個波的不同傳播速度,因為他們穿過的渥拉斯頓棱鏡的下部和上部部分的折射率差。在下半部分中的棱鏡,波陣面進行完全補償中的上半部分時,通過下和上半部的幾何路徑是相同的相移。然而,穿越點的波前相差的中心經驗的下層或上層的棱鏡,這會導致在剪切軸的方向的每單位長度的恒定相移的一半的旅程,通過較長的。相移是平等的,但相反,普通和特殊的波陣面。其結果是,在一端的棱鏡,非凡的波陣面出現提前普通的波陣面,而在相應的位置上的另一端,普通的波陣面射出棱鏡之前的非同尋常的波陣面。渥拉斯頓棱鏡平面的焦點,或干擾,發生在棱鏡的中心之間的光路的下部和上部的石英楔等于。出于這個原因,它往往是很難(或不可能),以適應標準的顯微鏡物鏡,其中往往有一個埋內心深處的透鏡的后側焦點面(即必須在物理上與渥拉斯頓棱鏡干涉平面重合),用于與一個Wollaston棱鏡。

                                                                常規Wollaston棱鏡類似,基本利用Nomarski棱鏡的設計(圖3(b))也包括兩個石英楔膠合在一起為斜邊的。上楔塊常規渥拉斯頓石英楔子是相同的,但通過切割石英晶體產生的傾斜的光軸的方向上,相對于平坦面的棱鏡下楔塊被修改。,當楔塊相結合形成的化合物的雙折射棱鏡的焦點(干擾)面在于在網站上的棱鏡板外幾毫米。產生這種情況的,因為剪切發生在石英棱鏡楔形,而不是上面的接合邊界在較低的空中接口,在渥拉斯頓棱鏡。石英楔在利用Nomarski棱鏡之間的界面的折射現象導致剪切的波陣面會聚以外的棱鏡與一個交叉點(圖3(b)中示出)。利用Nomarski棱鏡焦平面的實際位置可以調整超過幾個毫米的范圍內,通過改變在較低的石英楔子用來構造棱鏡的光軸的傾斜角度。

                                                                通常是構建現代DIC顯微鏡與諾馬斯基棱鏡,以避免物鏡光圈間隙問題。事實上,修改后的棱鏡通常采用兩個光束在聚光鏡中的占空比和物鏡的焦平面剪切和重組。雖然有聚光棱鏡,而這往往是精確定位的開口面內的空間的限制少,在大多數情況下,仍然使用利用Nomarski棱鏡。利用Nomarski棱鏡可以專為聚光鏡,以產生一個干涉平面位于更接近于棱鏡比用于與物鏡構成。其結果是,除了被安裝在具有不同的幾何形狀的幀,利用Nomarski棱鏡發現在現代DIC顯微鏡往往是不同的切割是不可互換的。

                                                                Sénarmont DIC光學系統

                                                                傳統的微分干涉顯微鏡的光學系統包含一個位于聚光鏡前和分析器(第二偏振器)插入到上述物鏡的途徑,通常是在一個中間管或結合在該幀的我利用Nomarski棱鏡的偏振器。偏振器的方向的振動面的透射軸定位的東 - 西,當分析儀相對于交叉的偏振器(透射軸是北 -?? 南)。離開偏振器的線偏振光被分離成兩個部分,利用Nomarski棱鏡裝在聚光鏡附近的光圈光闌孔徑的共軛焦平面。由棱鏡入射的波前被剪切成正交偏振分量,由聚光光學系統的平行呈現,然后利用照射試樣。

                                                                后面的位置的光學路徑中的物鏡是利用Nomarski棱鏡的第二(通常是裝在一個可調節的滑動框架),這是用來重組剪切后孔中的共聚焦面的波陣面后,他們已收集和集中由物鏡。從重組的波陣面的圓形,橢圓偏振光通過組件通過分析器,隨后進行干擾顯微鏡上面的中間圖像平面生成DIC圖像。

                                                                de senarmont intro figure4

                                                                在一個完全對齊的DIC顯微鏡,聚光棱鏡成像通過聚光鏡和物鏡組件到物鏡棱鏡,在每一點上沿表面的棱鏡,相對于彼此反轉匹配,使波陣面的剪切。翻譯兩種棱鏡沿剪切軸(垂直于顯微鏡的光學軸)產生的波陣面是均勻的跨顯微鏡孔徑不匹配。相對于普通的波陣面的相位移的轉移的非凡的波陣面通過棱鏡的翻譯通常被稱為偏置相位差在DIC的顯微鏡的介紹由于利用Nomarski棱鏡之一的是,橫向移動(通常是物鏡的棱鏡),波前對背景變得越來越遲鈍,彼此同相。因此,新興從物鏡諾馬斯基的棱鏡的光的極化向量方位可調節線性(無翻譯),通過不同程度的橢圓形,甚至圓形。

                                                                DIC的光學系統偏置遲緩介紹產生變化的強度(振幅)在試樣階段梯度水平,從而導致產生的取向依賴性明亮的區域和較亮的背景上的陰影疊加。強度梯度沿剪切軸的聚光鏡和物鏡棱鏡發生,一般出現源于一個45度角(西北向東南或反之亦然)當試樣中的目鏡觀察。顯微鏡的光學軸在一個方向或另一個跨可移動棱鏡將不同的正交波陣面之間的相位關系,在該樣本中扭轉陰影鑄取向的。最終的結果是使標本圖像偽三維浮雕地區增加光學路徑長度(傾斜相梯度)顯得更亮或更暗,表現出路徑長度減小出現反向。

                                                                引入偏置相位差,這是越來越流行的一種替代技術,是四分之一波長的相位差板安裝在固定的方向之間的偏振器和聚光鏡棱鏡(稱為Sénarmont?DIC補償,如上文所討論)。在最大的消光(匹配棱鏡與沒有施加偏壓,請參閱圖4(b)段),相位差板的快軸與偏振器的透射軸對齊,兩個光學單元可以是(往往都是)內包含的的基礎上,在顯微鏡上的同一外殼中。Sénarmont補償器的備用位置,在顯微鏡配備適當的中間管(參見圖1),之間的的物鏡棱鏡和分析儀。

                                                                為了使引入的偏置使用Sénarmont補償器,偏振器的透射軸旋轉(加或減45度,見圖4(a)和圖4(c))相對于相位差板的快軸,這保持固定到分析儀的透射軸相對于在一個90度的角。當補償器的快軸相一致(平行)與偏振器的透射軸,只有直線偏振光通過通過Sénarmont補償聚光棱鏡,作為圖4(b)中示出。但是,當偏振器的透射軸旋轉時,從四分之一波長的相位差板的過程中出現的波陣面成為橢圓偏振光。旋轉偏振器在一個方向上會產生右撇子的橢圓偏振光(圖圖4(a)),而在另一個方向上旋轉偏振器將改變的矢量軌跡生成慣用左手的橢圓形掃描(如圖4中所示(三))。

                                                                de senarmont intro figure5

                                                                當起偏器的透射軸的方向達到無論是加或減45度(相等于四分之一波長的相位差),補償器的光通過圓偏振光(再次在任何一個慣用左手或右手的意義上)。因為橢圓或圓偏振光代表的普通和特殊的新興的從Sénarmont補償的波陣面之間的相位差,偏置引入到系統時的波陣面進入聚光鏡利用Nomarski分光鏡棱鏡和剪切(圖5)。正偏壓時,得到的偏振片在一個方向上旋轉,而通過在相反的方向旋轉偏振器引入負偏壓。引入由一個Sénarmont的補償相位差的量可以定量,根據公式確定:

                                                                相位差(以納米為單位)=θλ/180

                                                                其中θ是有關的相位差板的快軸的偏振器的透射軸的旋轉角(以度計算),λ是平均波長的光通過補償器。鎢鹵素燈照明的情況下,常常被認為是波長約為550納米的計算涉及偏置相位差。使用Sénarmont補償,偏壓之間的二十分之一,全波長的相位差值可以很容易地測量,其精確度為0.15納米。

                                                                偏置相位差的影響,DIC的光學系統引入由一個去Sénarmont的補償器補償器三個設置在圖5中示出。在圖5中示一個單一的波前進入Wollaston棱鏡的中央部分的一個例子,但利用Nomarski棱鏡會以同樣的方式操作。當偏振器的透射軸平行排列的四分之一波長的相位差板的快軸(圖4(b)和圖5(b)),直線偏振光從補償器,是下楔塊表面聚光鏡的入射渥拉斯頓棱鏡(圖5(b)所描述的)。在DIC的顯微鏡中,入射的線偏振光的方向以45度的角度下楔塊組件的渥拉斯頓棱鏡(或利用Nomarski)的快軸和慢軸。進入棱鏡后,偏振光分離成正交分量,遍歷低級石英楔子的快軸和慢軸,兩個棱鏡之間的楔形件的邊界處剪切。因為線性的波陣面的單相形式存在,當它進入棱鏡,最初的正交分量的相位時,它們在空氣 - 石英邊界,但在棱鏡內經過相移。

                                                                如前所述,上楔塊的渥拉斯頓棱鏡的下部由普通的波陣面的相位的偏移量,增益后,普通和特殊波交換標識在兩個楔塊之間的交界處。最終的結果是一個取消的相位移位,產生在棱鏡內的,正交的波陣面從沃拉斯頓棱鏡彼此同相(圖5(b))中出現。在這種條件下,光學系統具有最大的消光,目前只有大的相位梯度試樣中是可見的。這些相位梯度被疊加在一個非常黑暗的背景上,或黑色,暗場圖像的外觀上。

                                                                偏振器是相差的零位置在去Sénarmont的補償器在任一方向旋轉時的情況是完全不同。新興從補償展覽階段的波前轉移傳授橢圓形或圓形的字符向量的正交波分量的總和。當偏振器是向左旋轉30度(負偏壓相位差;圖圖5(a)),生成由去Sénarmont補償普通波前進入Wollaston棱鏡的前非凡的波陣面,射出棱鏡(交換身份后)非凡的波前提前普通眼波。的基本結果是產生的光程差,這是需要引入的偏置相位差。發生相反的效果(圖圖5(c))時,Sénarmont的偏振器是向右轉動(正偏壓相位差),從普通的波陣面的渥拉斯頓棱鏡提前非凡的波陣面。

                                                                不管偏置是否被引入到翻譯的物鏡利用Nomarski棱鏡或旋轉的偏振片上解Sénarmont補償由一個微分干涉對比系統,最終結果是相同的。在適當配置的顯微鏡正確對齊科勒照明,在光源和聚光棱鏡的圖像是由光學系統(聚光鏡和物鏡)轉移到位于上面的物鏡的后側焦點面倒立的第二利用Nomarski棱鏡。整個面部的聚光棱鏡的線性相移被精確地補償由一個相反的相移在物鏡棱鏡。翻譯的物鏡棱鏡沿剪切方向不改變的相移分布,而是,添加或減去一個恒定的相位差在整個顯微鏡的光圈。旋轉在去Sénarmont補償偏振器中相同的方式,還引入了一個變量,并控制相位差。匹配的棱鏡系統使圖像形成發生與每一個波前對投影來自聚光鏡的孔徑相同的偏置電壓的相位差,不論路由通過它穿過試樣到達物鏡。

                                                                de senarmont intro figure6

                                                                圖6給出的是一系列的數字圖像使用偏置在一些中間步驟中的二十分之一到四分之一波長的相位差范圍內的記錄,可在微分干涉對比。標本為5微米(厚度)制備人頰粘膜上皮細胞(臉頰)鋪展在緩沖鹽水溶液中的顯微鏡載玻片上,并通過一個170微米的玻璃蓋成像。細胞表現出波動的厚度,其范圍從約1至4微米的區域。的試樣細節和陰影鑄的偽三維效果是最顯著的在較低的偏置相位差值(圖6(a)和圖6(b)),但細標本細節的對比度和清晰度都惡化,作為偏置相位差的移交增加(圖圖6(c)至6(f)條)。在偏置遲緩最高值(四分之一波長;圖6(f)條),對比度極差,極少數的結構細節可見。對于這個特殊的試樣,最佳相位差范圍介于的二十分之一的波長的十二分之一。

                                                                由于標本中的光路梯度增加DIC的顯微鏡,所以圖像的對比度。不同程度地改變偏置相位差也能產生顯著的對比波動在試樣中觀察到的目鏡(圖6)。在一般情況下,誘導的翻譯的物鏡棱鏡,或通過旋轉在去Sénarmont補償偏振器之間的普通和特殊的波陣面的位移,是最佳的程度上的順序小于十分之一波長。但是,該值是在很大程度上依賴于試樣的厚度,有用的范圍的生物樣本的偏置相位差之間的三十分之一和四分之一波長。對比標本中具有非常大的光學梯度往往可以受益于更大的偏置相位差值(全波長)。成一個微分干涉對比顯微鏡使偏置遲緩階段更容易被觀察的標本,并與傳統的膠片或數碼相機系統,極大地方便了成像努力。

                                                                Sénarmont DIC顯微鏡補償遲緩板

                                                                通常所說的補償相位差板領域的偏振光顯微鏡,補償可以利用在DIC的顯微鏡操作量的對比從普通和非凡的波陣面之間的偏置遲緩。補償板賦予更大的控制,用于調節有關的背景強度和顏色值中的試片細節的對比度,也使能更精確地調整偏置波陣面之間的相位差。這些雙折射元件也經常采用的光學透明的標本的染色,通常呈現在有限范圍內的灰度值。

                                                                開成一個微分干涉對比光學系統引入偏置與解Sénarmont補償顯微鏡配備一個全波的相位差板可以被添加到光學與牛頓的干涉色和染色的標本,提供更定量的路徑的差異(圖7中所示的信息)。相位差板,可以被插入到一個Sénarmont物鏡棱鏡和分析儀或補償器和聚光鏡的棱鏡之間的DIC顯微鏡的光學路徑。許多顯微鏡在中間管或為此目的而設計的臺下聚光器殼體有一個插槽。一階補償器(通常被稱為一個全波一階的紅色的相位差板)具有等于全波長的可見光(約550納米),綠色區域中的延遲值,除了引入了頻譜的干涉色檢體和背景(圖7)。與補償器代替,綠色光無法通過分析儀,因為它從與偏振器的電場矢量具有相同的方向的線偏振光的相位差板。然而,在紅色和藍色光譜區域的波陣面發生相位差小于一個波長,成為橢圓偏振光,使它們能夠通過分析器傳遞組件。其結果是,這些顏色混合形成的視場中的品紅色的背景。

                                                                de senarmont intro figure7

                                                                當試樣被觀察到在白光(鎢鹵素燈照明)與Sénarmont DIC的光學系統和一階相位差板,背景出現洋紅色,而圖像的對比度,在將顯示在二階的藍色和黃色的顏色的一階(取決于取向)的牛頓的干涉色譜。插入光通路與相位差板,通過以下方式獲得旋轉在Sénarmont補償偏振器的偏置相位差小的變化產生的快速變化,具有大的光學路徑長度梯度的結構中觀察到干涉色。這種技術是有用的顏色(光染色)引進具有高折射率的界限,如細胞膜,細胞內顆粒大,纖毛和細胞核的地區。標本功能顯示的干涉色,一個的米歇爾征收顏色圖表上的值進行比較,以獲得的光程差的估計。

                                                                圖7所示的是一些已通過兩個標準偏置相位差技術和光學染色成像,并用一個形象的顏色顯示的偽三維浮雕呈現半透明的標本。圖7(a)示出了上面的偏置約十二分之一波長的相位差設置在櫛魚鱗橫紋。進入顯微鏡的光學路徑中插入一階相位差板,會產生圖7中所示的圖像(b)中,呈現櫛鱗二階藍色和品紅色的背景上的黃色的干涉色的一階。同樣地,的籔枝螅水螅息肉由低中間偏置相位差值(圖7(c))顯示一個顯著量的結構,而且還具有豐富的光譜的色彩與在光路中的相位差板(圖7(四)) 。光染色,也可用于生產彩色反轉陰影施放效果,在圖7(e)和7(F)所示為透明粘稠部分小鼠腎臟組織。雖然圖7中的圖像不顯示隱藏的科學信息有關的標本,他們這樣做有可能提前DIC的光學顯微鏡技術,作為一個合法的科學和藝術之間的橋梁。

                                                                解讀de Sénarmont DIC圖片

                                                                通過觀察在幾乎每一個產生的圖像通過偏置相位差引入由一個去Sénarmont的補償陰影鑄造定向本,光學剪切力的方向上是明顯的,可以精確的軸連接區域顯示的最高和最低的強度(振幅)的值定義為。檢體相梯度(偽立體感的程度)的由Sénarmont DIC賦予的對比度水平旋轉補償器中的偏振器的光學系統引入的偏置相位差的量的函數。利用Nomarski棱鏡設計由于剪切軸線是固定的,涉及的波陣面取向的DIC的顯微鏡的其他方面的限制,在軸方向不能改變,以影響通過一個簡單的設置在顯微鏡標本的對比。然而,普通和非凡的波陣面之間的相對相位延遲是可以逆轉的,旋轉Sénarmont的補償偏振片到相應的負值。當相位延遲被改變如剛才所述,在試樣上的亮區和暗邊的方向扭轉180度。在本質上,可改變相對于試樣的剪切軸的顯微鏡的唯一機制是調整試樣本身,機動的方向,得益于利用循環360度可旋轉的階段。

                                                                SénarmontDIC的顯微鏡檢查每個試樣將有一個最佳的偏置補償器,產生在最終圖像中對比度最高水平的相位差設置。非常薄的試樣顯示一個淺的折射率梯度,如活細胞的培養,一般可使用同樣低的偏置設置(小翻譯偏振器)僅稍大于最大的相移標本中存在(約順序的二十分之一波長,或約30納米)。然而,較厚的標本往往需要較高的偏置設置(四分之一波長)大型聚光鏡孔產生令人滿意的結果,通常是通過光學切片。Sénarmont補償最佳偏置延遲設置,因為許多試樣組成的功能,顯示的各種不同的尺寸和折射率,通常是一種妥協。

                                                                光學切片與de Sénarmont的DIC顯微鏡

                                                                圖像標本Sénarmont DIC大型聚光鏡和顯微鏡物鏡的數值孔徑的能力,使創造的光學部分聚焦的圖像平面顯著淺。如果不刪除的焦點在側面從明亮的區域的光暈和分散注意力的強度波動的干擾,該技術得到銳利的圖像,都整齊地從復雜的三維相位標本切片。此屬性通常利用取得清晰的輪廓,在復雜的組織細胞的光學部分的焦平面上的上方和下方的結構以最小的干擾。

                                                                在所有傳統形式的透射和反射的光學顯微鏡,孔徑光闌聚光鏡發揮了重要作用,定義圖像的對比度和分辨率。產生增強的對比度的同時,減小光圈的大小字段和整體圖像的清晰度增加了深度。但是,如果聚光鏡隔膜關閉太多,衍射工件變得清楚和分辨率犧牲。通常情況下,最佳的光圈設置是準確地渲染足夠的對比度和保留圖像分鐘功能需要的分辨率,而避免衍射文物的標本細節之間的一種折衷。

                                                                de senarmont intro figure8

                                                                當聚光鏡調整可變光闌到物鏡后光圈大小的大約70%的,最高性能Sénarmont DIC光學系統產生優異的對比度。然而,這些顯微鏡也執行雄偉當打開聚光鏡隔膜相匹配的物鏡后孔直徑。為了實現光學切片實驗的分辨率和對比度之間的最佳平衡,這是關鍵是正確地配置在顯微鏡科勒照明,利用Nomarski棱鏡組件,分析儀,Sénarmont補償精確對準。

                                                                圖8中所示的光學部分的的團藻起居室菌落使用de SénarmontDIC實現在一個倒置的組織培養顯微鏡的偏置相位差采取水生微生物組成的數百到數千相同的綠藻細胞具有大致相同的直徑,但組織分為以下幾種形態圖案。的周邊上的菌落,單個細胞被布置在一個半透明的廣泛間隔層,稱為粘液,如在圖8中所示的(一)。到更遠的質量,菌落形成幾個集中的球形群體的生殖細胞,稱為gonidia,從而產生小女兒在父殖民地的殖民地(圖8(b))。由于本顯微鏡聚焦在最上層的菌落中的粘液(圖圖8(c)),結構的細節在各個細胞變為可見的,但被屏蔽許多細胞由子集落的。

                                                                生物薄試樣(10至20微米厚)通常會產生貧困的光學部分在較低的放大倍率,但與高倍率物鏡的數值孔徑大(60倍和100倍)時,可視往往揭示大量的內部細節。較厚的標本可以隨時切片在低倍率像差最小。收集從較厚的生物標本,特別是浸漬在水溶液中的生理鹽水或緩沖溶液的光學部分,往往阻礙了玻璃蓋和安裝介質之間的界面處的折射率不連續性所產生的球面像差此神器將減少在光學部分系列的分辨率更高的穿透深度。

                                                                結論

                                                                在微分干涉顯微鏡的幾何路徑長度和試樣的折射率變化,利用Nomarski棱鏡安置在聚光鏡中產生的兩個正交的波陣面的相位差引入。最終的結果是,由物鏡利用Nomarski棱鏡和隨后的圖像形成復合,這些波作為一個組件穿過分析儀之間的波陣面的橢圓偏振。偏置相位差可以被引入到系統中翻譯的物鏡棱鏡沿顯微鏡光軸或將一個四分之一波長板的偏振器或分析儀(補償的Sénarmont)相結合。因此,通過簡單的旋轉控制旋鈕,可以得到最佳的對比度,場亮度和靈敏度。使用的Sénarmont補償DIC顯微鏡代替了傳統的依靠翻譯的物鏡諾馬斯基的棱鏡的配置有幾個優點,而這些好處是部分負責該技術的日益普及。

                                                                定量測定偏置遲緩應用于光學系統的確切數額難以確定,大多數聘請一個翻譯諾馬斯基的棱鏡物鏡后焦平面DIC顯微鏡。在某些情況下,利用Nomarski棱鏡,具有高精度的千分尺控制轉換設備的幀已被開發,這些組件可以被用來精確地測量的偏差量,介紹了以小的增量移動棱鏡。然而,任何DIC顯微鏡可以配置為使用de Sénarmont補償測量精確的偏置遲緩,僅僅通過增加一個刻度旋轉偏光鏡或分析儀和固定的四分之一波長相位差板的眼鏡直通車。

                                                                偏置相位差進行定量測量的最方便的配置的一個示出由圖1中的顯微鏡。該儀器包含一個位于兩者之間,在物鏡轉換器,利用Nomarski棱鏡觀察管在主框架上的中間管。中間管插入到一個標準的550納米的Sénarmont補償器(最初設計用于偏振光測量)安置在偏振器的快軸平行的固定框架(東 - 西)和分析儀的慢軸平行(朝南)。以上的de Sénarmont補償是一個360度調節的幀含有一個線性偏振元件(作為分析儀),畢業于單度。游標尺的線性偏振器的透射軸的方向,能夠準確地測定,并提供控制的能力(表壓)的電平的偏置相位差的波長的幾級分的顯微鏡常伴有圓形的控制旋鈕。,當DIC顯微鏡最初翻譯的物鏡諾馬斯基的棱鏡設計介紹偏置遲緩,被配置為剛才所描述的,準確的測定偏置遲緩是可能的。然而,在這些條件下,重要的是進行初始配置匹配棱晶(物鏡和聚光鏡)前插入Sénarmont的補償器和旋轉分析儀的干涉條紋的最大程度的重疊(最大消光)。

                                                                SénarmontDIC補償的另一個重要優點是這些組件的重要的圖像形成和光圈值的共軛平面中的顯微鏡的光學列車接近。與滑動的物鏡利用Nomarski棱鏡設計的顯微鏡必須物理翻譯化合物棱鏡元件的光學路徑,而對面的顯微鏡觀察到的水平應用到系統中的偏置相位差。在許多情況下,特別是如果棱鏡框架松散適合在山上,嚴肅的形象轉變可能發生在棱鏡翻譯,阻礙標本觀察能力和捕捉圖像。圖像移位不能發生過程中引入的偏置相位差與一個去Sénarmont DIC顯微鏡,主要是因為在補償相位差板和旋轉偏振器被定位在聚光鏡前或后的物鏡,在顯微鏡的照明通路,和不內的圖像形成的光學元件。這種差異應該是選擇定量DIC實驗顯微鏡配置時要考慮的一個重要因素。

                                                                比較傳統和Sénarmont DIC顯微鏡配置時,符合人體工程學的考慮也很重要。現代顯微鏡的設計階段和重點定位在前面顯微鏡基地,桌面高度,和近在咫尺操作的控制旋鈕。這些特性允許更寬松的姿勢與雙手在桌面上舒適地休息,以幫助消除疲勞,減輕壓力的可能性,這最終會導致神經肌肉疾病。在傳統的DIC顯微鏡,操作者必須不斷提高手(臂)以上的水平的物鏡,以便調整利用Nomarski棱鏡的位置。然而,在符合人體工程學Sénarmont設計中,補償器組件被放置在顯微鏡的基礎上的前端的照明端口,非常接近下降的聚焦旋鈕和階段平移控制桿。DIC顯微鏡的所有顯微鏡控制機制上接近,大大降低了操作者的疲勞,在長時間的連續觀測。

                                                                增強視頻顯微技術,利用精確的偏置介紹由de Sénarmont補償的相位差值。經常提到的縮寫,VE-DIC(微分干涉對比視頻增強),該技術是能夠記錄標本精細結構的細節,那就是超越的復合式顯微鏡的光學分辨率。視頻增強DIC顯微鏡一直是一個強有力的研究工具,在細胞生物學個人微管的組裝動力學測量和可視化細菌鞭毛的運動,這兩者都沒有解決使用其他技術。如上所討論的,非常薄的DIC樣品的大多數是最好的觀察偏置的平均相位差值的波長的二十分之一。然而,當視頻增強DIC圖像分辨率標本(如微管和微型的細胞器),偏置的相位差值下降約百分之一的波長必須采用。顯然,這些非常輕微的水平低下是最好的實現具有高精確度,刻度和游標裝備,旋轉偏振器(儀)組件設計與de Sénarmont的補償。

                                                                中為首的微分干涉顯微鏡的成像優勢,不管偏置相位差引入的機制,通過這種機制,是(與暗場或相襯)更小的試樣的功能的圖像沒有被遮蓋住的毗鄰區域具有大的光學路徑梯度。此外,中性灰色的背景上顯示的圖像的陰影鑄造,耦合到一起與那些更大的(例如,分鐘附加物活細胞或動態的夾雜物和移動的細胞器,細胞內的非常小的特征成像的靈敏度) ,傳統對比度增強技術是一個顯著的改進。這些好處,除了對比度控制寬動態范圍和淺景深,都促成了該技術的廣泛普及。



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