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                                                                奧林巴斯顯微鏡成像,什么是反卷積?

                                                                2019-06-12 18:37:48 116

                                                                ?反卷積進行大量計算的圖像處理技術,正被越來越多地利用改善在顯微鏡拍攝的數字圖像的對比度和分辨率?根據一套旨在消除或扭轉引起的物鏡的孔徑有限的顯微鏡圖像中存在的模糊的方法,這些方法的基礎是。

                                                                幾乎任何數字熒光顯微鏡獲得的圖像可以被反卷積,以及一些新的應用程序正在開發,應用反卷積技術透射光下的各種采集圖像對比度增強策略。?其中最合適的改進的主體,通過反卷積是從一系列的光學部分構成的三維蒙太奇。

                                                                圍繞收購的串行光學部分的卷積分析的基本概念示意圖如圖1。?的檢體是一種理想化的單元格從一系列的光學部分(右圖)是沿z軸的一個廣義的光學顯微鏡記錄。?對于每個試樣中的焦平面,由檢測器記錄,相應的圖像平面中,并隨后被存儲在一個數據分析計算機。?卷積分析,整個系列的光學部分進行分析,以建立一個三維的蒙太奇。

                                                                作為一種技術,反卷積常常建議共聚焦顯微鏡作為一種很好的替代。?這不是嚴格正確的,因為在共聚焦顯微鏡中使用的針孔孔徑獲得的圖象也可以分析通過反卷積技術。?然而,大多數的反卷積實驗文獻報道的適用于記錄,可在一個標準的寬視場熒光顯微鏡圖像。?現代卷積算法取得可比分辨率的圖像共聚焦顯微鏡。?事實上,共聚焦顯微鏡和廣角卷積顯微鏡都工作通過去除圖像模糊,但這樣做相反的機制。?共聚焦顯微鏡防止外的焦點模糊,從被檢測的目標和檢測器,通過它,可以通過只在聚焦光線之間放置一個針孔孔徑。?與此相反,寬視場顯微鏡允許模糊的光線到達檢測器(或圖像傳感器),但反卷積技術,然后施加到所產生的圖像,以減去模糊的光,或將其重新分配到源。?共聚焦顯微鏡特別適合研究厚的標本,如胚胎或組織,而廣角卷積顯微鏡已被證明是一個強大的工具,需要非常低的光線水平,如活細胞熒光標記的蛋白質和核酸的成像標本。

                                                                圖像退化的來源

                                                                來源可分為4個獨立的現象:噪聲,散射,眩光,模糊的圖像退化。?圖2給出的視覺沖擊每個這些相同的圖像的例子。?卷積方法的主要任務是從圖像中刪除焦模糊。?反卷積算法去除噪聲,但其整體性能,這是一個相對簡單的方面。

                                                                噪聲可以被描述為一個準隨機排列紊亂圖像中的細節,(在其最嚴重的形式)時遇到的外觀類似白噪聲鹽和胡椒噪聲?,什么被認為是在廣播電視接收不良(圖2(a))。?這種類型的噪音被稱為“準隨機的”,因為可以預測的統計分布是已知的源,如果力學。?在數字顯微鏡,噪聲的主要來源是信號本身或數字成像系統(通常被稱為光子散粒噪聲?)。?兩個噪聲源的機制是可以理解的,因此,噪聲的統計分布是已知的。?信號相關的噪聲可以由泊松分布特征,而從成像系統所產生的噪音往往遵循高斯分布。?由于數字法師常見的噪聲源和分布是這么好理解,它可以很容易地通過應用適當的圖像過濾器,這通常是大多數卷積軟件包包括一個可選的“前處理”例行去除。

                                                                散點圖通常是指作為一個隨機擾動引起的光通過于異構折射率區域的一個標本。?分散的凈效應是真正的隨機圖像細節紊亂,表現在圖2(b)。?雖然沒有完全令人滿意的方法已被開發來預測散布在一個給定的試樣,它已被證明的散射程度是高度依賴于試樣的厚度和材料的試樣的光學特性的和周圍的嵌入。?散射增加與試樣的厚度和內部組件內的試樣的折射率的非均質性。

                                                                類似的分散,眩光是一個隨機的光的干擾,但發生在光學系(透鏡,濾光片,棱鏡,透鏡安裝座等),而不是在試樣的顯??微鏡。?眩光,在現代的顯微鏡的水平已被最小化,由鏡頭和過濾器與抗反射涂層的就業機會,透鏡形成技術,光學水泥,玻璃配方的細化。?圖2(c)示出了不受控制的眩光的效果。

                                                                所描述的非隨機傳播的光,通過成像系統的光學系(圖2(d))發生模糊。?源模糊的最顯著的是衍射,并且被認為是只限于由模糊的圖像的分辨率衍射極限的?。?這表示任何成像系統的特性的限制,并在評估的光學系統的分辨率極限是決定性因素。?光學理論提出了復雜的模型,可應用于現代高速計算機的協助下,在光學顯微鏡拍攝的數字圖像模糊。?這是反卷積的基礎。?由于其反卷積的根本的重要性,模糊理論模型,將討論在本節的其他部分要詳細得多。?然而,應該強調的是,所有的成像系統產生的模糊獨立于其他形式的圖像劣化引起的試件或相應的儀器電子。?從其他類型的退化,使反卷積技術模糊消除的可能性,正是這種獨立性的光模糊。

                                                                光與物質的相互作用是主要的散射,眩光,模糊的物理起源。?然而,每種材料的組合物和在給定的材料(無論是玻璃,水,或蛋白質)的分子排列賦予它自己的特殊的光學性質。?對于反卷積的目的,有什么區別的位置,他們發生的可能性,產生這些現象的數學模型,分散,防眩光,和模糊。?由于分散是一個本地化的,不規則的現象,發生在試樣,它已被證明難以模型。?與此相反,由于模糊的顯微鏡光學系統(主要的目標)是一個函數,它可以建模與相對簡單。?這種模式使得它可以扭轉的模糊數學運算,卷積采用這種模式來扭轉或消除模糊。

                                                                點擴散函數

                                                                模糊模型是根據光學理論中已逐漸形成一個三維的點擴散函數(PSF)的概念上。?這一概念是至關重要反卷積,并應清楚地了解,為了避免成像偽影。?點擴散函數是基于一個無限小的點源的光,在檢體(對象)的空間。?的顯微鏡成像系統,因為只收集由這點發射的光的一小部分,它不能將光聚焦成一個完美的三維圖像的點。?相反,出現點擴大,并蔓延到一個三維的衍射圖案。?因此,點擴展函數的正式定義由一個理想的點光源產生的三維衍射圖案。

                                                                點擴散函數,這取決于所使用的攝像模式(寬視場,激光共聚焦,透過光),具有不同的和獨特的形狀和輪廓。?在寬視場熒光顯微鏡,點擴散函數的形狀類似于,加寬環喇叭形的光所包圍的長方形的“足球”。?在三維空間中的點擴展函數來描述,它是常見的應??用的坐標系的x,y和z三個軸()×和y是平行的試樣的焦平面和z是平行于光軸顯微鏡。?在這種情況下,顯示為在xy平面上的一組同心環的點擴展函數,并類似于沙漏的xz和yz平面中(如在圖3中示出)。?通過中心的廣角點擴散函數的XY片揭示了一組同心圓環:所謂的艾里斑?,通常引用文本中的經典光學顯微鏡。

                                                                在圖3中示出球面像差的不同程度的點擴散函數的兩個XZ突起。?的光軸平行于垂直軸的圖像。?在左邊顯示的點擴散函數最小的球面像差,而在右邊顯示一個顯著程度的??畸變?請注意,軸向不對稱,加寬的中央節點,在右側圖像沿著光軸導致退化的軸向分辨率和模糊信號。?從理論上講,點擴展函數的大小是無限的,而遠離焦點的平面的光強度的總和等于焦點處的總強度。?然而,光強下降迅速,并最終成為區分噪音。?在一個unaberrated的點擴散函數的記錄,可有高數值孔徑(1.40)油浸物鏡,占用0.2平方微米的焦點平面的光傳播區域超過90倍,在1微米以上和以下的集中。?用來記錄這些點擴散函數的圖像的檢體是一個直徑為0.1微米的熒光珠安裝在甘油(折射率等于1.47),與具有圖中所示的折射率的浸沒油。

                                                                的點擴展函數的一個重要的考慮因素是如何影響在顯微鏡圖像形成。?的圖像形成處理的圖像為基本單元的點擴展函數的理論模型。?換句話說,點擴散函數是磚的房子的圖像。?最好的圖像可以永遠是一個組裝點擴展函數,并增加放大倍率將不會改變這個事實。?作為一個著名的理論光學教科書(Born和狼:?光學原理?)解釋說,“這是不可能的目鏡,增加了電源的主圖像的每個元素,襯托出細節沒有出現在主圖像是一個小的衍射圖案,和實際圖象,通過目鏡觀察,只有這些圖案的放大圖像的合唱“。

                                                                作為一個例子,考慮人口的微小熒光珠蓋玻片顯微鏡載玻片之間夾著。?在此試樣中揭示了一個在焦圖像云點,其中每一個,檢查時,在高分辨率下,實際上是一個微小的一套環(實際上,艾里斑所包圍的磁盤,請參閱圖4(a)) 。?如果此焦點若干取出試樣,將出現更大的一組同心環,其中每個點是在聚焦的圖像(圖4(b))。?當在此試樣中的三維圖像被收集,然后一個完整的點擴散函數的記錄,可在每個胎圈。?描述會發生什么情況,每個點光源后,通過成像系統的點擴散函數。

                                                                剛剛描述的模糊處理,數學建模為一個卷積。?卷積運算的描述試樣中的每一個點的點擴散函數的應用從該對象中的每個點發出的光,以產生最終的圖像的點擴展函數的卷積。?不幸的是,此卷積導致點中的試樣,成為模糊圖像中的區域。?試樣中的每個點的熒光圖像中的每一個點的亮度由卷積運算是線性相關。?因為點擴散函數是三維的,模糊的點擴展函數是固有三維的現象。?焦平面的圖像從任何包含模糊的光點位于該平面混合在一起,模糊的光點,對原產于其他焦平面。

                                                                可以概括的情況下,形成圖像的點擴展函數的卷積中的試樣的想法。?解卷積逆轉這一進程,并嘗試重新構建試樣從一個模糊的圖像。

                                                                畸變的點擴散函數

                                                                定義的點擴展函數可以利用衍射的數學模型理論上或經驗上的熒光珠(參見圖3)獲取的三維圖像。?一個理論的點擴散函數一般具有軸向和徑向對稱。?實際上,點擴散函數是在xy平面的上方和下方(軸對稱)和繞z軸(徑向對稱)旋轉對稱。?一個經驗性的點擴散函數可以顯著偏離完美對稱(如圖3)。?這種偏差,通常被稱為像差?,成像系統的光學火車,尤其是目標的任何組件中所產生的凹凸或偏移量,但也可發生與其它組分如鏡,分束器,管透鏡,過濾器,隔膜,和光圈。?的光學元件和顯微鏡對準更好的質量就越高,越接近的經驗點擴散函數其理想的對稱形狀。?兩個共聚焦和去卷積顯微鏡依賴于盡可能接近理想的情況下的點擴展函數。

                                                                眾所周知,任何經驗豐富的專業顯微鏡,光學顯微鏡,遇到的最常見的像差是球面像差。?這種像差的表現形式為軸向不對稱的點擴散函數的形狀,大小,并相應增加,特別是沿z軸(圖3)。?其結果是一個相當大的損失,分辨率和信號強度。?在實踐中,最常見的原點的球面像差是物鏡前透鏡的液浸介質和安裝介質,在其中沐浴試樣的折射率之間的不匹配。?一個巨大的重點應放在盡量減少這種無所不在的像差的重要性。?卷積雖然可以部分恢復丟失的分辨率,再多的圖像處理,可以恢復丟失的信號。



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