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                                                                尼康顯微鏡,物鏡的分辨率

                                                                2019-06-12 18:30:41 64

                                                                ?光學顯微鏡分辨率被定義為上仍然可以由觀察者或攝像機系統作為單獨的實體來區分一個標本兩點之間的最短距離。?這一重要的概念,例如,列于下面的圖(圖1),在那里光從樣本的點源在顯微鏡中間像平面顯示為艾里衍射圖案。

                                                                顯微鏡物鏡的分辨率極限是指其在衍射圖(圖中的說明)2緊密間隔的艾里磁盤之間進行區分的能力。?中間像平面附近的衍射圖形的三維表示被稱為點擴散函數?,并且示于圖1的下部。?檢體圖像是由一系列形成艾里圖案和說明了兩個二維和三維的緊密間隔的點光源來表示。

                                                                分辨率在光學顯微鏡有點主觀的價值,因為在高放大倍率,圖像可能會出現不清晰,但還是可以解決的物鏡的最大能力。?數值孔徑確定一個物鏡的分辨能力,但整個顯微鏡的光學系的總分辨率也取決于聚光鏡的數值孔徑時。?較高的總系統的數值孔徑時,分辨率越高。

                                                                顯微鏡光學系統的正確定位是非常重要的也是為了確保最大的分辨率。?臺下聚光必須匹配的物鏡相對于數值孔徑和調整光圈光闌精確光錐的形成和標本的照明。?用于圖像的標本的光的波長光譜也是通過顯微鏡得到的分辨率的程度的決定因素。?較短的波長是能夠解決的細節在更大程度比是較長波長的光。?有已衍生來表達的數值孔徑,波長和分辨率之間的關系數的公式

                                                                分辨率(R)=??/(2NA) (1)
                                                                分辨率(R)= 0.61??/NA (2)
                                                                分辨率(R)= 1.22??/(NA(OBJ)+ NA(COND)) (3)

                                                                其中,r是分辨率(兩個對象之間的最小可分辨間距),NA是一個通用術語,在顯微鏡的數值孔徑,λ是成像波長,NA(OBJ)等于物鏡的數值孔徑,和NA(COND)的聚光鏡的數值光圈。?注意,等式(1)(2)由乘法系數,這是0.5為公式(1)和0.61為差異方程(2)。這些方程是基于多種因素(包括各種光學物理學家的理論計算的)來核算的物鏡和聚光鏡的行為,并且不應被認為是任何一個一般物理定律的絕對值。?在某些情況下,如共焦和熒光顯微鏡,分辨率實際上可能超過置于由這三個方程中任一項的限制。?其它因素,如低樣品的對比度和亮度不理想可以用于較低分辨率,并且更經常的情況是,R(大約0.25?微米的使用550納米的中間光譜的波長),以及數值孔徑的真實世界的最大值1.35到1.40未在實踐中實現。?下表(表1)提供了一個列表的分辨率(r)和數值孔徑(NA)的值由物鏡放大倍率和修正。

                                                                分辨率與數值孔徑由物鏡修正
                                                                ? 物鏡類型
                                                                ? 平場消色差 平場螢石 平場復消色差透鏡
                                                                放大 NA 分辨率?
                                                                (μm)
                                                                NA 分辨率?
                                                                (μm)
                                                                NA 分辨率
                                                                (μm)
                                                                4X 0.10 2.75 0.13 2.12 0.20 1.375
                                                                10X 0.25 1.10 0.30 0.92 0.45 0.61
                                                                20X 0.40 0.69 0.50 0.55 0.75 0.37
                                                                40X 0.65 0.42 0.75 0.37 0.95 0.29
                                                                60X 0.75 0.37 0.85 0.32 0.95 0.29
                                                                100X 1.25 0.22 1.30 0.21 1.40 0.20
                                                                NA =數值孔徑
                                                                表1

                                                                當在顯微鏡是在完美對準,并與臺下聚光適當匹配的物鏡,那么我們可以替換為物鏡的數值孔徑為等式(1)(2),與添加的結果是等式(3)簡化為公式(2)。?要注意的一個重要的事實是,倍率沒有出現在任何這些方程的一個因素,因為只有數值孔徑和照明光的波長確定試樣的分辨率。

                                                                正如我們所提到的(與所用的方程可以看出)的光的波長是在顯微鏡的分辨率的重要因素。較短波長產生較高的分辨率(對r值越低),反之亦然。?在光學顯微鏡的最大分辨率是實現了近紫外光,最短的有效成像波長。?近紫外光之后是藍色,然后綠色,最后紅光在解決標本細節的能力。?在大多數情況下,顯微鏡使用所產生的白光通過一個鹵鎢燈泡照亮標本。?可見光光譜集中在大約550納米,綠色光的主波長(我們的眼睛是最敏感的綠光)。?它是這樣的波長,是用來計算表1中的分辨率值。?數值孔徑值也是在這些方程中重要和更高的數值孔徑也將產生更高的分辨率。?光對分辨率的波長,在一個固定的數值孔徑(0.95)的效果,被列在表2中,以生產降低程度的分辨率的較長的波長。

                                                                分辨率與波長
                                                                波長?
                                                                (nm)
                                                                分辨率
                                                                (微米)
                                                                360 0.19
                                                                400 0.21
                                                                450 .24
                                                                500 0.26
                                                                550 0.29
                                                                600 0.32
                                                                650 0.34
                                                                700 0.37
                                                                表2

                                                                顯微鏡的分辨能力的光學系統的最重要的特征,并影響一個特定試樣的細節來區分的能力。如上所討論的,在確定的分??辨率的主要因素是物鏡的數值孔徑,但分辨率也取決于樣品的種類,照明的相干性,像差校正的程度,以及其他因素如任一中的光學系統的對比度增強的方法顯微鏡或在試樣本身。?在最后的分析中,分辨率是直接關系到顯微鏡的放大倍數有用和標本細節的感知限度。



                                                                電話咨詢
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