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                                                                顯微鏡分類和工作原理

                                                                2019-06-12 19:22:35 306

                                                                顯微鏡是觀察細胞的主要工具。根據光源不同,可分為光學顯微鏡和電子顯微鏡兩大類。前者以可見光(紫外線顯微鏡以紫外光)為光源,后者則以電子束為光源。

                                                                —、光學顯微鏡

                                                                (一)、普通光學顯微鏡

                                                                普通生物顯微鏡由3部分構成,即:①照明系統,包括光源和聚光器;②光學放大系統,由物鏡和目鏡組成,是顯微鏡的主體,為了消除球差和色差,目鏡和物鏡都由復雜的透鏡組構成;③機械裝置,用于固定材料和觀察方便(圖2-1)。

                                                                尼康E-600顯微鏡

                                                                圖2-1 尼康E-600顯微鏡

                                                                顯微鏡物象是否清楚不僅決定于放大倍數,還與顯微鏡的分辨力(resolution)有關,分辨力是指顯微鏡(或人的眼睛距目標25cm處)能分辨物體最小間隔的能力,分辨力的大小決定于光的波長和鏡口率以及介質折射率,用公式表示為:

                                                                分辨力計算公式

                                                                式中:n=介質折射率;α=鏡口角(標本對物鏡鏡口的張角),N.A.=鏡口率(numeric aperture)。鏡口角總是要小于180?,所以sina/2的最大值必然小于1。

                                                                介質折射率

                                                                制作光學鏡頭所用的玻璃折射率為1.65~1.78,所用介質的折射率越接近玻璃的越好。對于干燥物鏡來說,介質為空氣,鏡口率一般為0.05~0.95;油鏡頭用香柏油為介質,鏡口率可接近1.5。

                                                                普通光線的波長為400~700nm,因此顯微鏡分辨力數值不會小于0.2μm,人眼的分辨力是0.2mm,所以一般顯微鏡設計的最大放大倍數通常為1000X。

                                                                (二)、熒光顯微鏡

                                                                尼康E800熒光DIC顯微鏡

                                                                圖2-2 尼康E800熒光DIC顯微鏡

                                                                細胞中有些物質,如葉綠素等,受紫外線照射后可發熒光;另有一些物質本身雖不能發熒光,但如果用熒光染料或熒光抗體染色后,經紫外線照射亦可發熒光,熒光顯微鏡(圖2-2,3,4)就是對這類物質進行定性和定量研究的工具之一。

                                                                落射式照明原理

                                                                圖2-3 落射式照明原理

                                                                ?

                                                                熒光顯微鏡和普通顯微鏡有以下的區別:

                                                                1、照明方式通常為落射式,即光源通過物鏡投射于樣品上(圖2-3);
                                                                  2、光源為紫外光,波長較短,分辨力高于普通顯微鏡;
                                                                  3、有兩個特殊的濾光片,光源前的用以濾除可見光,目鏡和物鏡之間的用于濾除紫外線,用以保護人目。

                                                                熒光顯微鏡照片

                                                                圖2-4 熒光顯微鏡照片(微管呈綠色、微絲紅色、核藍色)

                                                                (三)、激光共聚焦掃描顯微鏡

                                                                ?

                                                                激光共聚焦掃描顯微鏡

                                                                圖2-5 激光共聚焦掃描顯微鏡

                                                                ?

                                                                LCSM照片,藍色為細胞核,綠色為微管

                                                                圖2-6 LCSM照片,藍色為細胞核,綠色為微管

                                                                激光共聚焦掃描顯微鏡(laser confocal scanning microscope,圖2-5、6)用激光作掃描光源,逐點、逐行、逐面快速掃描成像,掃描的激光與熒光收集共用一個物鏡,物鏡的焦點即掃描激光的聚焦點,也是瞬時成像的物點。由于激光束的波長較短,光束很細,所以共焦激光掃描顯微鏡有較高的分辨力,大約是普通光學顯微鏡的3倍。系統經一次調焦,掃描限制在樣品的一個平面內。調焦深度不一樣時,就可以獲得樣品不同深度層次的圖像,這些圖像信息都儲于計算機內,通過計算機分析和模擬,就能顯示細胞樣品的立體結構。
                                                                激光共聚焦掃描顯微鏡既可以用于觀察細胞形態,也可以用于細胞內生化成分的定量分析、光密度統計以及細胞形態的測量。

                                                                (四)、暗視野顯微鏡

                                                                暗視野顯微鏡(dark field microscope,圖2-7)的聚光鏡中央有當光片,使照明光線不直接進人物鏡,只允許被標本反射和衍射的光線進入物鏡,因而視野的背景是黑的,物體的邊緣是亮的。利用這種顯微鏡能見到小至 4~200nm的微粒子,分辨率可比普通顯微鏡高50倍。

                                                                暗視野照明方式

                                                                圖2-7 暗視野照明方式

                                                                (五)、相差顯微鏡

                                                                相差顯微鏡(phasecontrast microscope,圖2-8、9)由P.Zernike于1932年發明,并因此獲1953年諾貝爾物理獎。這種顯微鏡最大的特點是可以觀察未經染色的標本和活細胞。

                                                                相差顯微鏡的基本原理是,把透過標本的可見光的光程差變成振幅差,從而提高了各種結構間的對比度,使各種結構變得清晰可見。光線透過標本后發生折射,偏離了原來的光路,同時被延遲了1/4λ(波長),如果再增加或減少1/4λ,則光程差變為1/2λ,兩束光合軸后干涉加強,振幅增大或減下,提高反差。在構造上,相差顯微鏡有不同于普通光學顯微鏡兩個特殊之處:

                                                                1、環形光闌(annular diaphragm)位于光源與聚光器之間,作用是使透過聚光器的光線形成空心光錐,焦聚到標本上。

                                                                2、相位板(annular phaseplate)在物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板,可將直射光或衍射光的相位推遲1/4λ。分為兩種:
                                                                  ①A+相板:將直射光推遲1/4λ,兩組光波合軸后光波相加,振幅加大,標本結構比周圍介質更加變亮,形成亮反差(或稱負反差)。
                                                                  ② B+相板:將衍射光推遲1/4λ,兩組光線合軸后光波相減,振幅變小,形成暗反差(或稱正反差),結構比周圍介質更加變暗。

                                                                相差顯微鏡照明原理

                                                                圖2-8 相差顯微鏡照明原理

                                                                一種介殼蟲的染色體

                                                                圖2-9 一種介殼蟲的染色體(PCM照片)

                                                                (六)、偏光顯微鏡

                                                                偏光顯微鏡(polarizing microscope)用于檢測具有雙折射性的物質,如纖維絲、紡錘體、膠原、染色體等等。和普通顯微鏡不同的是:其光源前有偏振片(起偏器),使進入顯微鏡的光線為偏振光,鏡筒中有檢偏器(一個偏振方向與起偏器垂直的的起偏器),這種顯微鏡的載物臺是可以旋轉的,當載物臺上放入單折射的物質時,無論如何旋轉載物臺,由于兩個偏振片是垂直的,顯微鏡里看不到光線,而放入雙折射性物質時,由于光線通過這類物質時發生偏轉,因此旋轉載物臺便能檢測到這種物體。

                                                                (七)、微分干涉差顯微鏡

                                                                1952年,Nomarski在相差顯微鏡原理的基礎上發明了微分干涉差顯微鏡(differential interference contrast microscope)。DIC顯微鏡又稱Nomarski相差顯微鏡(Nomarki contrast microscope),其優點是能顯示結構的三維立體投影影像。與相差顯微鏡相比,其標本可略厚一點,折射率差別更大,故影像的立體感更強。

                                                                DIC顯微鏡的物理原理完全不同于相差顯微鏡,技術設計要復雜得多。DIC利用的是偏振光,有四個特殊的光學組件:偏振器(polarizer)、DIC棱鏡、DIC滑行器和檢偏器(analyzer)。偏振器直接裝在聚光系統的前面,使光線發生線性偏振。在聚光器中則安裝了石英Wollaston棱鏡,即DIC棱鏡,此棱鏡可將一束光分解成偏振方向不同的兩束光(x和y),二者成一小夾角。聚光器將兩束光調整成與顯微鏡光軸平行的方向。最初兩束光相位一致,在穿過標本相鄰的區域后,由于標本的厚度和折射率不同,引起了兩束光發生了光程差。在物鏡的后焦面處安裝了第二個Wollaston棱鏡,即DIC滑行器,它把兩束光波合并成一束。這時兩束光的偏振面(x和y)仍然存在。最后光束穿過第二個偏振裝置,即檢偏器。在光束形成目鏡DIC影像之前,檢偏器與偏光器的方向成直角。檢偏器將兩束垂直的光波組合成具有相同偏振面的兩束光,從而使二者發生干涉。x和y波的光程差決定著透光的多少。光程差值為0時,沒有光穿過檢偏器;光程差值等于波長一半時,穿過的光達到最大值。于是在灰色的背景上,標本結構呈現出亮暗差。為了使影像的反差達到最佳狀態,可通過調節DIC滑行器的縱行微調來改變光程差,光程差可改變影像的亮度。調節DIC滑行器可使標本的細微結構呈現出正或負的投影形象,通常是一側亮,而另一側暗,這便造成了標本的人為三維立體感,類似大理石上的浮雕(圖2-10)。

                                                                DIC顯微鏡下的硅藻

                                                                圖2-10 DIC顯微鏡下的硅藻(偽彩色)

                                                                DIC顯微鏡使細胞的結構,特別是一些較大的細胞器,如核、線粒體等,立體感特別強,適合于顯微操作。目前像基因注入、核移植、轉基因等的顯微操作常在這種顯微鏡下進行。

                                                                (八)、倒置顯微鏡

                                                                組成和普通顯微鏡一樣,只不過物鏡與照明系統顛倒,前者在載物臺之下,后者在載物臺之上(圖2-11),用于觀察培養的活細胞,具有相差物鏡。

                                                                萊卡倒置顯微鏡

                                                                圖2-11 萊卡倒置顯微鏡

                                                                進入20世紀80年代以來,光學顯微鏡的設計和制作又有了很大的發展,其發展趨勢主要表現在,注重實用性和多功能方面的改進。在裝配設計上趨于采用組合方式,集普通光鏡加相差、熒光、暗視野、DIC、攝影裝置于一體,從而操作靈活,使用方便。

                                                                二、電子顯微鏡

                                                                (一)、透射電子顯微鏡

                                                                1、基本原理

                                                                在光學顯微鏡下無法看清小于0.2μm的細微結構,這些結構稱為亞顯微結構(submicroscopic structures)或超微結構(ultramicroscopic structures;ultrastructures)。要想看清這些結構,就必須選擇波長更短的光源,以提高顯微鏡的分辨率。1932年Ruska發明了以電子束為光源的透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM),電子束的波長要比可見光和紫外光短得多,并且電子束的波長與發射電子束的電壓平方根成反比,也就是說電壓越高波長越短。目前TEM的分辨力可達0.2nm。

                                                                電子顯微鏡(圖2-12)與光學顯微鏡的成像原理基本一樣,所不同的是前者用電子束作光源,用電磁場作透鏡。另外,由于電子束的穿透力很弱,因此用于電鏡的標本須制成厚度約50nm左右的超薄切片。這種切片需要用超薄切片機(ultramicrotome)制作。電子顯微鏡的放大倍數最高可達近百萬倍、由電子照明系統、電磁透鏡成像系統、真空系統、記錄系統、電源系統等5部分構成。

                                                                不同光源的波長

                                                                JEM-1011透射電子顯微鏡

                                                                圖2-12 JEM-1011透射電子顯微鏡

                                                                2、制樣技術

                                                                1)超薄切片

                                                                通常以鋨酸和戊二醛固定樣品,以環氧樹脂包埋,以熱膨脹或螺旋推進的方式推進樣品切片(圖2-13),切片厚度20~50nm,切片采用重金屬鹽染色,以增大反差(圖2-14)。

                                                                萊卡超薄切片機

                                                                圖2-13 萊卡超薄切片機

                                                                內質網透射電鏡圖

                                                                圖2-14 內質網透射電鏡圖(偽彩色)

                                                                2)負染技術

                                                                負染就是用重金屬鹽(如磷鎢酸、醋酸雙氧鈾)對鋪展在載網上的樣品進行染色;吸去染料,樣品干燥后,樣品凹陷處鋪了一薄層重金屬鹽,而凸的出地方則沒有染料沉積,從而出現負染效果(圖2-15),分辨力可達1.5nm左右。

                                                                肌動蛋白纖維的負染電鏡照片

                                                                圖2-15 肌動蛋白纖維的負染電鏡照片

                                                                3)冰凍蝕刻

                                                                冰凍蝕刻(freeze-etching)亦稱冰凍斷裂(freeze-fracture)。標本置于-100?C的干冰或-196?C的液氮中,進行冰凍。然后用冷刀驟然將標本斷開,升溫后,冰在真空條件下迅即升華,暴露出斷面結構,稱為蝕刻(etching)。蝕刻后,向斷面以45度角噴涂一層蒸汽鉑,再以90度角噴涂一層碳,加強反差和強度。然后用次氯酸鈉溶液消化樣品,把碳和鉑的膜剝下來,此膜即為復膜(replica)。復膜顯示出了標本蝕刻面的形態,在電鏡下得到的影像即代表標本中細胞斷裂面處的結構(圖2-16)。

                                                                冰凍蝕刻電鏡照片

                                                                圖2-16冰凍蝕刻電鏡照片

                                                                (二)、掃描電子顯微鏡

                                                                JEOL掃描電子顯微鏡

                                                                圖2-17 JEOL掃描電子顯微鏡

                                                                掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope,SEM,圖2-17、18、19)于20世紀60年代問世,用來觀察標本的表面結構。其工作原理是用一束極細的電子束掃描樣品,在樣品表面激發出次級電子,次級電子的多少與電子束入射角有關,也就是說與樣品的表面結構有關,次級電子由探測體收集,并在那里被閃爍器轉變為光信號,再經光電倍增管和放大器轉變為電信號來控制熒光屏上電子束的強度,顯示出與電子束同步的掃描圖像。圖像為立體形象,反映了標本的表面結構。為了使標本表面發射出次級電子,標本在固定、脫水后,要噴涂上一層重金屬微粒,重金屬在電子束的轟擊下發出次級電子信號。

                                                                目前掃描電鏡的分辨力為6~10nm,人眼能夠區別熒光屏上兩個相距0.2mm的光點,則掃描電鏡的最大有效放大倍率為0.2mm/10nm=20000X。

                                                                光學顯微鏡、TEM、SEM成像原理比較

                                                                1219974858.jpg圖2-18 光學顯微鏡、TEM、SEM成像原理比較

                                                                人類血細胞SEM照片

                                                                圖2-19 人類血細胞SEM照片

                                                                (三)、掃描隧道顯微鏡

                                                                掃描隧道顯微鏡(scanning tunneling microscope,STM)由Binnig等1981年發明,根據量子力學原理中的隧道效應而設計。當原子尺度的針尖在不到一個納米的高度上掃描樣品時,此處電子云重疊,外加一電壓(2mV~2V),針尖與樣品之間產生隧道效應而有電子逸出,形成隧道電流。電流強度和針尖與樣品間的距離有函數關系,當探針沿物質表面按給定高度掃描時,因樣品表面原子凹凸不平,使探針與物質表面間的距離不斷發生改變,從而引起電流不斷發生改變。將電流的這種改變圖像化即可顯示出原子水平的凹凸形態。掃描隧道顯微鏡的分辨率很高,橫向為0.1~0.2nm,縱向可達0.001nm。它的優點是三態(固態、液態和氣態)物質均可進行觀察,而普通電鏡只能觀察制作好的固體標本。

                                                                利用掃描隧道顯微鏡直接觀察生物大分子,如DNA、RNA和蛋白質等分子的原子布陣,和某些生物結構,如生物膜、細胞壁等的原子排列。

                                                                三、顯微操作技術

                                                                尼康NT-88NE顯微操作/注射儀

                                                                圖2-20 尼康NT-88NE顯微操作/注射儀

                                                                顯微操作技術(micromanipulation technique)是指在高倍復式顯微鏡下,利用顯微操作器(micromanipulator,圖2-20)進行細胞或早期胚胎操作的一種方法。顯微操作器是用以控制顯微注射針在顯微鏡視野內移動的機械裝置。

                                                                顯微操作技術包括細胞核移植、顯微注射、嵌合體技術、胚胎移植以及顯微切割等。細胞核移植技術已有幾十年的歷史,Gordon等人(1962)對非洲爪蟾進行核移植獲得成功。我國著名學者童第周等在魚類細胞核移植方面進行了許多工作,并取得了豐碩成果。



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